Die Testleistungsdaten belegen die Nützlichkeit eines DIVA-Hauttestreagenz für Rinder (DST).

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12052 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Bacillus Calmette-Guérin (BCG), ein abgeschwächter Stamm von Mycobacterium bovis (M. bovis), ist der führende Impfstoffkandidat zur Bekämpfung der Rindertuberkulose (TB) bei Rindern. Allerdings führt die BCG-Impfung zu einer Sensibilisierung von Rindern gegenüber Rindertuberkulin, wodurch die Verwendung der aktuellen Tuberkulose-Überwachungstests bei Rindern beeinträchtigt wird. Um dieses Problem anzugehen, haben wir einen diagnostischen Hauttest entwickelt, der durch die BCG-Impfung nicht beeinträchtigt wird und in der Lage ist, BCG-geimpfte Tiere zu erkennen, die nach der Exposition gegenüber M. bovis anschließend Rinder-TB entwickeln. Aufbauend auf früheren Arbeiten mit selbst formulierten Protein-Cocktail-Reagenzien präsentieren wir hier Testleistungsdaten für ein einzelnes Fusionsprotein (DST-F), das die mykobakteriellen Antigene ESAT-6, CFP-10 und Rv3615c enthält und als „gebrauchsfertig“ formuliert ist ' Reagenz von einem kommerziellen Hersteller. Unsere Ergebnisse zeigen, dass im Gegensatz zu Tuberkulinreagenzien ein diagnostischer Hauttest mit DST-F bei mit BCG geimpften Tieren eine hohe Spezifität beibehielt. Darüber hinaus zeigte der DST-F-Hauttest eine hohe relative Empfindlichkeit bei der Identifizierung von mit M. bovis infizierten Tieren, einschließlich solcher, bei denen die BCG-Impfung nach experimenteller Exposition gegenüber M. bovis die Tuberkulosepathologie bei Rindern nicht verhindern konnte. Das DST-F wird derzeit in Großbritannien in Feldversuchen getestet, um seine Zulassung und Kommerzialisierung zu unterstützen.

Rindertuberkulose (TB) ist eine Krankheit, die weltweit wichtige Nutztierarten befällt. Obwohl die Krankheit durch Krankheitserreger der Mykobakteriengruppe Mycobacterium tuberculosis verursacht wird, wird Rindertuberkulose in vielen Ländern (einschließlich dem Vereinigten Königreich) fast ausschließlich durch M. bovis verursacht. Rindertuberkulose ist eine wichtige Quelle wirtschaftlicher Verluste, da sowohl die Produktivität als auch die Kosten von Kontrollprogrammen sinken. Der weltweite wirtschaftliche Verlust wird auf rund 3 Milliarden US-Dollar pro Jahr geschätzt1. Darüber hinaus hat Rindertuberkulose schwerwiegende zoonotische Folgen, insbesondere in Ländern mit niedrigem bis mittlerem Einkommen, in denen die Pasteurisierung der Milch von Nutztieren nicht garantiert werden kann2.

Im Vereinigten Königreich wird, wie in vielen Ländern mit hohem Einkommen, eine Test- und Schlachtstrategie angewendet, die auf dem Single Intradermal Comparative Cervical Tuberculin (SICCT)-Test basiert, wobei manchmal ein Interferon-Gamma-Freisetzungstest als Zusatztest zur Maximierung der Ergebnisse eingesetzt wird Erkennung infizierter Tiere. Allerdings ist diese Kontrollstrategie mit hohen Kosten verbunden, sowohl aus finanzieller Sicht, da Schätzungen zufolge allein die Bekämpfung der Rindertuberkulose in England den Steuerzahler etwa 70 Millionen Pfund pro Jahr kostet, mit zusätzlichen Kosten von 50 Millionen Pfund für die Landwirte3, als auch aus ethischer Sicht, wo etwa 38.000 Rinder leben wurden zwischen Juli 2020 und Juni 2021 in GB abgeschlachtet, um die Krankheit zu bekämpfen. Daher hat die Entwicklung eines Rinderimpfstoffs gegen Rindertuberkulose hohe Forschungspriorität.

Bisher ist der einzige verfügbare Impfstoff gegen Rindertuberkulose Bacillus Calmette-Guérin (BCG), ein abgeschwächter Stamm von M. bovis, und Wirksamkeitsstudien zur Bewertung der Wirkung der BCG-Impfung gegen experimentelle M. bovis-Infektionen bei Rindern haben vielversprechende Ergebnisse gezeigt4,5 . Darüber hinaus wurde die Wirksamkeit der BCG-Impfung auch in Feldstudien nachgewiesen6,7,8,9. Obwohl Studien zeigen, dass die BCG-Impfung die Schwere der Rinder-TB-Erkrankung verringert, weisen sie auch darauf hin, dass sie nicht bei allen Geimpften einen vollständigen Schutz bietet10,11,12,13,14,15. Daher sind weiterhin diagnostische Tests erforderlich, um BCG-geimpfte Tiere zu erkennen, die nach Exposition gegenüber M. bovis Rinder-TB entwickeln. Leider führt die BCG-Impfung zu einer Sensibilisierung von Rindern gegenüber den aktuellen diagnostischen Hauttestreagenzien (d. h. gereinigten Proteinderivaten von Tuberkulin), was ihre Verwendung in dieser Situation ausschließt16. Um die Fortsetzung einer test- und schlachtbasierten Kontrollstrategie im Rahmen der BCG-Impfung sicherzustellen, haben sich die Forschungsanstrengungen daher auf die Entwicklung eines diagnostischen Hauttests konzentriert, der: (i) bei BCG-geimpften Tieren keine falsch positiven Hauttestreaktionen hervorruft; und (ii) ist in der Lage, BCG-geimpfte Tiere zu erkennen, die nach der Exposition gegenüber M. bovis anschließend Rinder-TB entwickeln. Die anfängliche Entwicklung dieses sogenannten „DIVA-Hauttests“ (DIVA: Detecting Infected among Vaccinated Animals) basierte auf der Bewertung von Cocktails rekombinanter mykobakterieller Proteine17 und führte zur Priorisierung der Proteine ESAT-6, CFP-10 und Rv3615c18, während die weitere Verfeinerung untersucht wurde Verwendung dieser als einzelnes Fusionsproteinreagenz, das „im eigenen Haus“ formuliert wurde19. Um diese Studien zu erweitern, haben wir eng mit einem kommerziellen Hersteller zusammengearbeitet, um ein „gebrauchsfertiges“ DIVA-Hauttest-Fusionsproteinreagenz (DST-F) herzustellen. Die Leistungsdaten für dieses Reagenz werden hier vorgestellt.

Um die Fähigkeit des DST-F zur Identifizierung infizierter Rinder zu beurteilen, wurde eine Reihe experimenteller M. bovis-Infektionsstudien (Tabelle 1; Studien 1–3) durchgeführt. Die Obduktion auf Rinder-TB-Pathologie und die Kultur postmortaler Gewebeproben bestätigten eine Infektion mit M. bovis bei allen 71 untersuchten Tieren (Daten nicht gezeigt). Insgesamt wurden 68 dieser Tiere positiv auf DST-F getestet (Tabelle 2), was mehr war als beim SICCT-Test (62 Testpositiv) und nur geringfügig weniger als beim SIT-Test (70 Testpositiv). . Obwohl dies ermutigende Leistungsdaten für DST-F bei mit M. bovis infizierten Tieren lieferte, sind die eigentliche Zielgruppe für diesen Test BCG-geimpfte Rinder, die nicht vollständig vor der Entwicklung von Rindertuberkulose geschützt sind. Um die Fähigkeit des DST-F zu beurteilen, BCG-geimpfte Rinder zu identifizieren, die nach experimenteller Exposition gegenüber M. bovis Anzeichen von Rindertuberkulose zeigten, führten wir drei separate Impfstoff-/Challenge-Experimente durch (Studien 4–6). Auch hier wurden am Ende jedes Experiments alle Tiere einer detaillierten Obduktion unterzogen, bei der Anzeichen einer Rinder-TB-Pathologie bewertet und Proben von Lymphknoten und Lungengewebe für die M. bovis-Kultur entnommen wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Abb. 1 zusammengefasst. In allen drei Experimenten war der Grad der sichtbaren Pathologie im Lymphknotengewebe in der geimpften/infizierten Tiergruppe im Vergleich zur nur infizierten Kontrollgruppe in diesem Experiment signifikant geringer. Ebenso war in zwei der drei Experimente der Gesamtwert der sichtbaren Läsionen in dieser Tiergruppe ebenfalls signifikant niedriger. Somit zeigten alle drei Experimente eine schützende Wirkung der BCG-Impfung auf die Schwere der TB-Pathologie bei Rindern nach einer experimentellen Infektion mit M. bovis. Allerdings deuten diese Ergebnisse auch darauf hin, dass BCG zwar die Schwere der TB-Pathologie bei Rindern einschränkt, es jedoch nicht per se eine Infektion mit M. bovis verhindert, da M. bovis aus postmortalem Gewebe von allen 73 mit BCG geimpften/M. bovis kultiviert werden konnte . Bovis-infizierte Tiere (Daten nicht gezeigt). Daher haben wir die Fähigkeit des DST-F-Reagenzes zum Nachweis der 72 kulturbestätigten BCG-geimpften/M beurteilt. Bovis-infizierte Tiere. Von diesen 72 Tieren wurden 65 positiv auf das DST-F-Reagenz getestet (Tabelle 2). Das ist mehr als beim SICCT-Test (61 Testpositiv), aber weniger als beim SIT-Test (72 Testpositiv). Für Nichtgeimpfte/M. Bovis-infizierte Kontrolltiere aus diesen Studien zeigten alle Anzeichen einer M. bovis-Infektion und wurden, mit Ausnahme eines Tieres in Studie 6, positiv auf das DST-F-Reagenz getestet. Alle Tiere in diesen Gruppen wurden auch bei den SICCT- und SIT-Tests positiv getestet.

Reduzierung der sichtbaren Pathologie der Rindertuberkulose bei BCG-Geimpften. Lymphknoten-, Lungen- und Gesamtpathologiewerte für die BCG-geimpften/M. Bovis-Infizierte (Vac/Inf) und die Nichtgeimpften/M. Bovis-infizierte Kontrollen (Inf) aus Studie 4 (A), Studie 5 (B) und Studie 6 (C). Jedes Symbol stellt ein einzelnes Tier dar, während horizontale Balken Gruppenmittelwerte darstellen. *p < 0,05, **p < 0,01, Mann-Whitney-Test.

Um das Ausmaß der durch DST-F verursachten falsch-positiven Ergebnisse zu beurteilen, wurden Hauttests in drei Gruppen nicht infizierter Tiere (Studien 7 bis 9) durchgeführt und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. In den beiden Studien mit Bei nicht infizierten Kontrolltieren wurden keine falsch positiven Reaktionen auf DST-F oder Tuberkulinreagenzien beobachtet. Ebenso wurden bei den 20 mit BCG geimpften Kälbern keine falsch positiven Reaktionen auf DST-F beobachtet (Studie 9). Im Gegensatz dazu reagierte ein hoher Anteil der mit BCG geimpften Kälber, die mit Tuberkulinreagenzien getestet wurden, falsch positiv, wobei 7/10 bzw. 10/10 beim SICCT- bzw. SIT-Test positiv ausfielen.

Die aus diesen neun Studien generierten Hauttestdaten wurden kombiniert und in Tabelle 3 zusammengefasst. Die relative Empfindlichkeit des DST-F beim Nachweis von mit M. bovis infizierten Tieren betrug 95 % und war damit höher als die des SICCT-Tests (89 %). aber niedriger als beim SIT-Test (99 %). Allerdings erreichte keiner dieser Unterschiede statistische Signifikanz. Die relative Empfindlichkeit des DST-F beim Nachweis von BCG-geimpften Tieren, die nach einer experimentellen M. bovis-Infektion Anzeichen einer Rindertuberkulose zeigten, war mit 90 % etwas geringer. Auch hier war dieser Wert höher als beim SICCT-Test (85 %), aber deutlich (p < 0,05, McNemar-Test) niedriger als beim SIT-Test (100 %). Keiner der drei Hauttests löste bei nicht infizierten Kontrolltieren falsch positive Reaktionen aus, was zu Spezifitätsschätzungen von 100 % führte. Ebenso wurden bei BCG-geimpften Tieren keine falsch positiven Reaktionen auf DST-F beobachtet, was wiederum zu einer Spezifitätsschätzung von 100 % führte. Im Gegensatz dazu wurden in dieser Tiergruppe signifikant niedrigere Werte für den SICCT-Test (p < 0,05, McNemar-Test) und den SIT-Test (p < 0,01, McNemar-Test) beobachtet, mit Spezifitätsschätzungen von 30 % bzw. 0 %.

Unsere anfängliche Entwicklung eines DIVA-Hauttestreagenzes basierte auf Cocktails rekombinanter mykobakterieller Proteine, die bei mit M. bovis infizierten Rindern immunogen waren, bei naiven oder BCG-geimpften Tieren jedoch keine Reaktionen hervorriefen17, und einem Cocktail bestehend aus ESAT-6 und CFP-10 und Rv3615c-Proteine wurden für die Bewertung in verschiedenen Rindergruppen priorisiert. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigten eine hohe Spezifität dieses Reagenzes, wenn es an mit BCG geimpften Tieren oder nicht infizierten Kontrolltieren getestet wurde, während es bei der Auswertung mit Standardinterpretation eine relative Empfindlichkeit für den Nachweis einer Infektion beibehielt, die der des Tuberkulin-SICCT-Tests ähnelt18. Aus fertigungstechnischer Sicht hat die Herstellung eines einzelnen Fusionsproteinreagenzes jedoch viele Vorteile gegenüber einer Herstellung, die aus einem Cocktail aus drei einzelnen Proteinen besteht. Beispielsweise ist für das Fusionsprotein nur ein einziger Produktionsdurchlauf erforderlich, im Gegensatz zu drei separaten Produktionsdurchläufen für die Komponenten des Cocktails. Darüber hinaus würde die Produktion eines einzelnen Fusionsproteins im Vergleich zur Herstellung des Cocktailreagenzes die erforderlichen zugehörigen Qualitätskontrolldaten um ein Drittel reduzieren. Schließlich wäre es nicht erforderlich, über ein System zur Formulierung eines Cocktailreagenzes aus den drei individuell hergestellten Komponenten zu verfügen. Proof-of-Concept-Daten zeigten, dass ein Fusionsprotein aus ESAT-6, CFP-10 und Rv3615c die In-vitro-IFN-γ-Produktion unter Verwendung mononukleärer Zellen des peripheren Bluts von mit M. bovis infizierten Rindern induzierte, jedoch nicht von naiven Kontrollen oder BCG-geimpften Tieren19. Darüber hinaus erzeugte dieses Fusionsprotein positive Hautreaktionen bei mit M. bovis infizierten Tieren, jedoch nicht bei naiven Kontrollen, wenn es „hausintern“ als Hauttestreagenz formuliert wurde19. Um dieses Reagenz zu einem potenziellen kommerziellen Produkt weiterzuentwickeln, haben wir mit dem Hersteller (z. B. Lionex) zusammengearbeitet, um ein Fusionsprotein-DIVA-Hauttestreagenz (bezeichnet als DST-F) herzustellen, das „direkt aus der Flasche“ verwendet werden kann ähnlich wie Tuberkulinreagenzien. Darüber hinaus wurden Qualitätskontrollprotokolle und Chargenfreigabekriterien (siehe Materialien und Methoden) entwickelt, um die Konsistenz von Charge zu Charge sicherzustellen und dabei eine mögliche Ausweitung auf die kommerzielle Produktion im Einklang mit den Standards der Guten Herstellungspraxis zu berücksichtigen. Insgesamt wurden DIVA-Hauttestreagenzien, die auf den Cocktail- und Fusionsproteinformulierungen basieren, direkt an 191 einzelnen Tieren getestet (unveröffentlichte Daten). Die statistische Analyse zur Bewertung der Testergebnisse der beiden Reagenzien zeigte eine beobachtete Übereinstimmung von 94 % mit einem Cohen-Kappa-Koeffizienten von 0,885 (95 %-KI von 0,819 bis 0,951), was auf eine „nahezu perfekte Übereinstimmung“20 zwischen den beiden Reagenzien hinweist (Daten nicht gezeigt). ). Angesichts der Herstellungsvorteile des Fusionsproteins wurde daher das DST-F-Reagenz als mögliches DIVA-Hauttestreagenz ausgewählt, das weiter vorangetrieben werden soll.

Wie in Tabelle 3 zusammengefasst, betrug die relative Sensitivität des DST-F bei der Identifizierung bestätigter experimentell mit M. bovis infizierter Tiere 95 % (95 %-KI von 88 % bis 98 %) und war damit höher als die des SICCT-Tests, der am durchgeführt wurde gleichzeitig bei diesen Tieren. Es ist jedoch zu beachten, dass diese Schätzung der relativen Sensitivität anhand experimentell infizierter Tiere erstellt wurde und die Leistung des DST-F-Tests bei Verwendung bei natürlich infizierten Rindern möglicherweise nicht vollständig widerspiegelt. Tatsächlich zeigten zuvor veröffentlichte Daten für die DIVA-Hauttest-Cocktail-Formulierung einen deutlich geringeren Anteil an Testpositiven bei natürlich infizierten Tieren im Vergleich zu experimentell infizierten Tieren (78 bzw. 100 %; p < 0,05, exakter Fisher-Test), obwohl dies hervorgehoben werden sollte dass der Anteil der natürlich infizierten Tiere, die beim Standard-SICCT-Test positiv getestet wurden, ebenfalls bei etwa 76 % lag18. Darüber hinaus zeigten unsere ersten Proof-of-Concept-Daten für die „interne“ Fusionsproteinformulierung ein ähnliches Ergebnis: 76 % der natürlich infizierten Tiere (16 von 21) im Vergleich zu 100 % der experimentell infizierten Tiere (6 von 6). Dies führt zu einem positiven Hauttestergebnis (Daten nicht angezeigt). Daher liegt ein Schwerpunkt unserer aktuellen Forschung darauf, die Leistung des DST-F bei einer erhöhten Anzahl natürlich infizierter Rinder weiter zu bewerten, um statistisch belastbare Präzisionsberechnungen der DST-F-Testempfindlichkeit in einem realistischen Szenario zur Unterstützung zukünftiger DST-F-Tests bereitzustellen Validierungsübungen.

Zahlreiche Impf-/Provokationsstudien der letzten 25 Jahre zeigen, dass die BCG-Impfung die Schwere der Rinder-TB-Erkrankung verringert4. Angesichts der Tatsache, dass mit BCG geimpfte Tiere immer noch Rindertuberkulose entwickeln können (wenn auch mit geringerem Schweregrad), ist es von entscheidender Bedeutung, dass wir die Fähigkeit diagnostischer Reagenzien zum Nachweis dieser Tiere verstehen. Zu diesem Zweck führten wir drei BCG-Impfungs-/M. bovis-Infektionsexperimente durch, um die relative Empfindlichkeit des DST-F beim Nachweis von Tieren zu bewerten, die nach Exposition gegenüber M. bovis Hinweise auf eine Rinder-TB-Erkrankung zeigten. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten eine hohe relative Sensitivität von 90 % (95 %-KI von 81 % bis 95 %), die sich nicht signifikant (p = 0,348, exakter Fisher-Test) von dem bei nicht geimpften / M geschätzten Wert unterschied. Bovis-infizierte Tiere (Tabelle 3). Im Vergleich zu nicht geimpften Tieren zeigten mit BCG geimpfte Rinder eine geringere Anzahl an Tuberkuloseläsionen, einen geringeren Schweregrad der Tuberkuloseläsionen und eine geringere Anzahl lebensfähiger Bakterien, die aus dem betroffenen Gewebe gewonnen wurden11,15,21,22,23. Daher ist zu erwarten, dass diese geringere Krankheitslast zu einer geringeren fortlaufenden Aktivierung von Effektorimmunreaktionen auf mykobakterielle Antigene führt, was wiederum die Empfindlichkeit diagnostischer Tests beeinträchtigen kann, die diese Reaktionen als Messwert verwenden. Vor diesem Hintergrund ist es ermutigend, dass die relative Empfindlichkeit des DST-F in der Zieltiergruppe hoch blieb, d. h. bei BCG-geimpften Tieren, die nach Exposition gegenüber M. bovis Hinweise auf Rindertuberkulose zeigten.

Um Spezifitätsdaten zu generieren, wurde das DST-F-Reagenz an zwei Tiergruppen getestet: (i) nicht infizierten Kälbern und (ii) BCG-geimpften Kälbern. Wie in Tabelle 3 gezeigt, stimmten die Ergebnisse dieser Studien mit zuvor veröffentlichten Daten für den DIVA-Hauttest-Cocktail18 überein und bestätigten, dass das DST-F-Reagenz unter experimentellen Bedingungen die hohe Spezifität beibehielt, die für einen mit der BCG-Impfung kompatiblen DIVA-Test erforderlich ist. Um dies zusätzlich zu bestätigen, ist derzeit eine weitere Bewertung der DST-F-Spezifität in Feldversuchen geplant (siehe unten).

Die hier präsentierten DST-F-Leistungsdaten waren Teil eines Antrags an die britische Veterinärmedizinbehörde für ein Tierversuchszertifikat (ATC), um den Beginn von Feldversuchen für das DST-F zu ermöglichen. Dieser Antrag enthielt auch eine Zusammenfassung des Herstellungsprozesses (bereitgestellt von Lionex) und die Ergebnisse einer Sicherheitsstudie, die von der Animal and Plant Health Agency (APHA) gemäß den Standards der Guten Laborpraxis durchgeführt wurde und bei der eine Einzel- und Wiederholungsdosis DST-F verabreicht wurde wurde sowohl bei naiven als auch mit BCG-geimpften Kälbern durch Überwachung der Injektionsstelle und allgemeiner Gesundheitsparameter (einschließlich Temperatur, klinische Beobachtungen und allgemeines Verhalten) beurteilt. Die Schlussfolgerung dieser Studie war, dass die intradermale Verabreichung von DST-F, entweder allein oder gleichzeitig mit der Verabreichung von Tuberkulin-Hauttestreagenzien, bei naiven oder BCG-geimpften Kälbern keine nachteiligen lokalen oder systemischen Auswirkungen hatte (Daten nicht gezeigt). Das ATC wurde erfolgreich verliehen, und derzeit laufen im Vereinigten Königreich Feldversuche, um zunächst die Sicherheit und Spezifität des DST-F-Reagenzes bei einer größeren Anzahl ungeimpfter Rinder im Feld zu bestätigen, bevor die Feldbewertung bei einer großen Anzahl von BCG fortgesetzt wird geimpften Rindern, mit der Absicht, dass die aus diesen Studien generierten Daten eine zukünftige Marktzulassung für das DST-F-Reagenz unterstützen werden.

Insgesamt wurden 3 Studien durchgeführt (Tabelle 1; Studien 1–3). In allen Fällen stammten männliche Kälber (im Alter zwischen 6 und 12 Monaten) aus offiziell von Rindertuberkulose freien Herden in Großbritannien, in denen in jüngster Zeit keine Rindertuberkulose aufgetreten war und die während des gesamten Experiments bei APHA Weybridge gehalten wurden. Hauttests wurden etwa 5 bis 6 Wochen nach der Infektion durchgeführt. Tierdetails sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Insgesamt wurden 3 Studien durchgeführt (Tabelle 1; Studien 4–6). Für die beiden an der APHA Weybridge durchgeführten Experimente (Studie 4 und 5) wurden männliche Kälber (im Alter zwischen 4 und 8 Monaten) aus offiziell von Rindertuberkulose freien Herden in GB gewonnen, die in der jüngeren Vergangenheit keine Rindertuberkulose hatten und bei APHA Weybridge gehalten wurden während des gesamten Experiments. Für das von AgResearch durchgeführte Experiment (Studie 6) wurden weibliche Rinder (ungefähr 12 Monate alt) aus Herden mit Tuberkulosefreiheit gewonnen, die aus einem Gebiet Neuseelands stammten, in dem Nutz- und Wildtiere frei von Tuberkulose waren. Die Tiere wurden auf der AgResearch-Aorangi-Farm gehalten und geimpft, während die Rinder unmittelbar vor der Infektion mit M. bovis zur Tuberkulose-Eindämmungseinheit auf der AgResearch-Kaitoke-Farm transportiert wurden. Hauttests wurden zwischen 8 und 14 Wochen nach der Infektion durchgeführt. Tierdetails sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Insgesamt wurden 2 Studien durchgeführt (Tabelle 1; Studien 7 und 8). Für Studie 7 wurden männliche Kälber (im Alter zwischen 8 und 12 Monaten) aus offiziell von Tuberkulose freien Herden in Großbritannien bezogen, die in der jüngeren Vergangenheit keine Rinder-Tuberkulose hatten und während des gesamten Experiments bei APHA Weybridge gehalten wurden. Für Studie 8 wurden Kälber (40–54 Tage alt) in eine DST-F-Sicherheitsstudie aufgenommen, die gemäß den Qualitätsstandards der Guten Laborpraxis (GLP) durchgeführt wurde, um Daten zur Unterstützung eines Antrags auf ein Tierversuchszertifikat beim Veterinary Medicines Directorate (Weybridge, Großbritannien) zu generieren ). Da die Aufsichtsbehörde unbedingt nachweisen musste, dass diese Kälber frei von Rindertuberkulose waren, wurden sie aus einem bekanntermaßen TB-freien Standort in Dänemark bezogen. Tierdetails sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Ähnlich wie oben beschrieben wurden auch Kälber (43–57 Tage alt) in eine DST-F-Sicherheitsstudie mit BCG-geimpften Kälbern aufgenommen. Hauttests wurden 7 Wochen nach der BCG-Impfung durchgeführt. Tierdetails sind in Tabelle 1 (Studie 9) zusammengefasst.

Alle Experimente mit lebenden Tieren wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften sowie in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. Tierversuche und Versuchsprotokolle wurden von einem benannten institutionellen Ausschuss genehmigt: Für die bei der APHA durchgeführten Arbeiten war dies das APHA Animal Welfare and Ethical Review Board (Referenzen 70/7737–2-007, PF7D840A5-2-004v, 70/7737–1- 012 und PFFFE51F-2–002), während dies für die bei AgResearch durchgeführten Arbeiten das Grasslands Animal Ethics Committee (Referenz AE 14.741) war.

Für alle Impfungen wurde der dänische BCG-Stamm 1331 (AJVaccines, Kopenhagen, Dänemark) verwendet. Alle BCG-Inokula wurden am Tag der Impfung hergestellt, indem jedes Fläschchen BCG mit 1 ml Sauton-Verdünnungsmittel rekonstituiert wurde und 0,5 ml den Tieren subkutan verabreicht wurden. Das verwendete Inokulum wurde durch Ausplattieren von Verdünnungsreihen titriert, um die tatsächlich abgegebene Dosis zu berechnen (Tabelle 1). In den Impfstoff-/Challenge-Experimenten erhielten nicht geimpfte Kontrolltiere entweder keinen BCG-Impfstoff (Studie 6) oder eine 0,5 ml subkutane Injektion von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Studien 4 und 5).

Tiere in den Studien 1 bis 6 wurden experimentell über den endotrachealen/endobronchialen Weg mit einem virulenten Stamm von M. bovis infiziert (AF2122/97 für die Studien 1 bis 5; 83/6235 für Studie 6). Kurz gesagt, für die Studien 1 bis 5 wurden Kälber mit 2 % Rompun (0,12 ml/50 kg, intravenös; Umkehrung mit der gleichen Dosis Antisedan, intravenös) sediert, bevor ein Endoskop durch die Nasenhöhle in die Luftröhre eingeführt wurde Abgabe des Inokulums (2 ml) durch eine Kanüle mit 1,8 mm Innendurchmesser direkt unterhalb der Hauptgabelung zwischen linkem und rechtem Lappen. Zwei ml PBS wurden verwendet, um etwaige Reste des Inokulums von der Kanüle abzuspülen. Anschließend wurden Kanüle und Endoskop herausgezogen und die Kanüle entsorgt. Der Kanal, durch den die Kanüle in das Endoskop eingeführt wurde, wurde mit 20 ml sterilem Wasser gespült und die Außenseite des Endoskops wurde mit sterilisierenden Tüchern abgewischt, bevor das nächste Tier infiziert wurde. Für Studie 6 wurden Kälber wie zuvor beschrieben infiziert21. Der M. bovis im Inokulum, das zur Infektion der Rinder verwendet wurde, wurde zur Bestimmung der KBE kultiviert. Für die Impfstoff-/Challenge-Experimente (Studien 4 bis 6) wurden die Tiere etwa 8 bis 10 Wochen nach der Impfung infiziert. Einzelheiten zur Herausforderungsdosis und zum Zeitpunkt der Herausforderung sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Am Ende des Experiments wurden an den infizierten Tieren Post-Mortem-Untersuchungen (PME) durchgeführt, um das Ausmaß der in der Lunge und den Lymphknoten beobachteten TB-Pathologie zu quantifizieren, wobei eine Modifikation eines zuvor veröffentlichten Bewertungssystems verwendet wurde24. In der Mehrzahl der Studien wurden folgende Lymphknoten untersucht: linker und rechter submandibulärer; linker und rechter medialer Retropharynx; kraniales Mediastinal; kaudales Mediastinal; linker und rechter Bronchialbereich; und kranial tracheobronchial. Ausnahmen bildeten die Studien 4 und 5, bei denen aus logistischen und praktischen Gründen die Kopflymphknoten (submandibulär und medial retropharyngeal) nicht untersucht wurden. Jeder Lymphknoten wurde seriell in 1 mm dicke Schnitte geschnitten und anhand der Anzahl und des Ausmaßes der beobachteten Läsionen anhand der folgenden Kriterien ein Pathologie-Score angewendet: Score 0 für keine sichtbaren Läsionen; Bewertung 1 für eine einzelne kleine Läsion (1–2 mm Durchmesser), Bewertung 2 für zwei bis fünf kleine Läsionen oder einen einzelnen großen Bereich (mindestens 5 mm x 5 mm); 3 Punkte für fünf bis zwanzig kleine Läsionen oder zwei bis drei große Bereiche; Punktzahl 4 für mehr als zwanzig kleine Läsionen oder mehr als drei große Bereiche; und 5 Punkte für eine konsolidierte Pathologie von über 50 % des Lymphknotens. Darüber hinaus wurde jeder Lungenlappen seriell in 5–10 mm große Abschnitte geschnitten und wie folgt bewertet: Bewertung 0 für keine sichtbaren Läsionen; Bewertung 1 für eine einzelne kleine Läsion (< 10 mm Durchmesser); Bewertung 2 für zwei bis fünf kleine Läsionen; Bewertung 3 für zwischen fünf und zwanzig kleine Läsionen oder einen einzelnen großen Bereich (> 10 mm Durchmesser); Punktzahl 4 für mehr als zwanzig kleine Läsionen oder mehr als einen großen Bereich; Score 5 für einen erheblich betroffenen Bereich der Lunge, der Läsionen enthält. Für die M. bovis-Kultur wurden auch postmortal Proben von Lymphknoten und Lungengewebe entnommen.

Bei PME gesammelte Gewebe wurden vor der Verarbeitung gefroren bei –80 ° C gelagert. Kurz gesagt, einzelne Proben wurden aufgetaut, in 10 ml PBS mit einem Seward Stomacher Paddle Blender homogenisiert und auf modifizierten 7H11-Agarplatten ausgebreitet16. Die Platten wurden mindestens 4 Wochen lang bei 37 °C inkubiert, bevor die einzelnen Kolonien auf den Platten gezählt wurden.

Gereinigte Proteinderivate von M. avium (PPD-A; 25.000 IU/ml) und M. bovis (PPD-B; 30.000 IU/ml) wurden von einem kommerziellen Hersteller (Thermo Fisher, UK) bezogen. Das DST-F-Reagenz, bestehend aus einem histidinmarkierten rekombinanten Fusionsprotein von ESAT-6, CFP-10 und Rv3615c in PBS, wurde von einem kommerziellen Hersteller (Lionex, Braunschweig, Deutschland) hergestellt. Kurz gesagt, das DST-F-Fusionsprotein wurde in Escherichia coli (E. coli) exprimiert, durch Nickelaffinitätschromatographie gereinigt, gegen 10 mM NH4HCO3 (pH 8,0) rückgefaltet, gegen PBS (pH 7,4) gepuffert und schließlich in PBS weiter verdünnt eine Konzentration von 300 µg/ml vor der Abfüllung in EP-Glasfläschchen vom Typ 1 mit Verschlussstopfen und versiegelt mit Aluminiumkappen. Zu den Chargenfreigabekriterien gehörten: Proteingehalt von 300 µg/ml ± 5 %; Western-Blot-Nachweis einer positiven Reaktion bei Verwendung von Anti-Histidin-Tags und proteinspezifischen Antikörpern, jedoch keiner Reaktion mit einem Anti-E. Coli-Antikörper; eine Reinheit von mehr als 95 % mittels SDS-PAGE und Densitometrieanalyse; Endotoxingehalt von weniger als 25 IU/mg; und Sterilität gemäß der Monographie 2.6 des Europäischen Arzneibuchs.

Der Hauttest wurde in Übereinstimmung mit den Anweisungen für Tuberkulosetests bei Rindern durchgeführt, die über das APHA Vet Gateway erhältlich sind. Kurz gesagt wurden Injektionsstellen am Rand des vorderen und mittleren Drittels des Halses auf beiden Seiten des Tieres abgeschnitten und die Hautdicke vor der Injektion aufgezeichnet. Tuberkulin- und DST-F-Hauttests wurden durch intradermale Injektion von 0,1 ml PPD-A und PPD-B bzw. DST-F-Reagenz durchgeführt. Nach 72 Stunden wurden die Hautteststellen durch Abtasten der Haut auf Reaktionen überprüft. Bei tastbaren Reaktionen wurde die Hautdicke an der Injektionsstelle erneut gemessen und aufgezeichnet. Wenn keine spürbare Reaktion festgestellt wurde, wurden die Werte vor der Injektion verwendet. Eine Ausnahme bildeten die GLP-Sicherheitsstudien (Studien 8 und 9), bei denen die Hautdicke nach 72 Stunden automatisch gemessen wurde. Die Ergebnisse werden als Zunahme der Hautdicke nach 72 Stunden im Vergleich zur Dicke vor der Injektion ausgedrückt. Die Zeitpunkte des Hauttests für jedes Experiment sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die Analysen wurden mit GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, USA) durchgeführt. Der Grad der Pathologie zwischen BCG-geimpften und Kontrollkälbern wurde mithilfe des Mann-Whitney-Tests verglichen. Gegebenenfalls wurden der McNemar-Matched-Pair-Test oder der exakte Fisher-Test verwendet, um die Anteile von Testpositiven und -negativen zu vergleichen. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde aus dem britischen Forschungsbudget für Rindertuberkulose (Zuschüsse SE3304 und SE3312) finanziert, das zentral von Defra im Namen von England, Schottland und Wales verwaltet und verwaltet wird. Die Autoren danken den APHA-Mitarbeitern der Animal Science Unit für ihr Engagement für das Wohlergehen der bei der APHA untergebrachten Tiere und der Scientific Services Unit für die Durchführung der DST-F-Sicherheitsstudien sowie Dr. Steve Houghton für die Beratung und Beratung zu diesem Thema regulatorische Anforderungen für die Beantragung eines Tierversuchszertifikats für das DST-F-Reagenz.

TB-Immunologie und Vakzinologie, Abteilung für Bakteriologie, Tier- und Pflanzengesundheitsbehörde, New Haw, Addlestone, KT15 3NB, Surrey, Großbritannien

Gareth J. Jones, Timm Konold, Shellene Hurley, Tom Holder, Sabine Steinbach, Mick Coad und H. Martin Vordermeier

AgResearch, Palmerston North, Neuseeland

D. Neil Wedlock & Bryce M. Buddle

Lionex Diagnostics and Therapeutics GmbH, Braunschweig, Deutschland

Mahaveer Singh

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HMV und GJJ haben das DST-F-Konzept entwickelt. MS hat die Produktion des DST-F-Reagenzes entwickelt. HMV, GJJ und DNW planten die Experimente und koordinierten die Tierversuche. TK, SH, TH, SS, MC und BMB führten die Tierversuche und/oder Laborversuche durch. GJJ analysierte die Daten und erstellte die Tabellen und Abbildungen. GJJ hat den Text geschrieben, der von HMV, DNW und MS bearbeitet wurde

Korrespondenz mit Gareth J. Jones.

HMV, GJJ, TK, SH, TH, SS und MC sind bei der Animal and Plant Health Agency (APHA) beschäftigt, die drei Patente für die Verwendung von Rv3615c in Diagnosetests für Rinder-TB hält (WO/2009/060184, WO/2011). /135369 und WO/2012/010875). Die Arbeit an der APHA wurde aus dem britischen Forschungsbudget für Rindertuberkulose finanziert, das von Defra im Namen von England, Schottland und Wales zentral verwaltet und verwaltet wird. MS ist Eigentümer der Lionex GmbH und besitzt Aktien des Unternehmens. Die übrigen Autoren (DNW und BMB) erklären keinen potenziellen Interessenkonflikt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jones, GJ, Konold, T., Hurley, S. et al. Die Testleistungsdaten belegen die Nützlichkeit eines DIVA-Hauttestreagenzes (DST-F) für Rinder, das mit der BCG-Impfung kompatibel ist. Sci Rep 12, 12052 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16092-8

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Eingegangen: 09. Mai 2022

Angenommen: 01. Juli 2022

Veröffentlicht: 14. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16092-8

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Die Testleistungsdaten belegen die Nützlichkeit eines DIVA-Hauttestreagenz für Rinder (DST).