Metatranskriptomik zeigt die Temperatur

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 21871 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Traditioneller Käse beherbergt komplexe mikrobielle Konsortien, die eine wichtige Rolle bei der Gestaltung typischer sensorischer Eigenschaften spielen. Allerdings gilt der mikrobielle Stoffwechsel als schwer kontrollierbar. Die Abfolge mikrobieller Gemeinschaften und die damit verbundene Genexpression wurden während der Reifung eines traditionellen italienischen Käses analysiert und dabei Parameter identifiziert, die geändert werden könnten, um die Reifung zu beschleunigen. Anschließend modulierten wir die Reifungsbedingungen und beobachteten konsistente Veränderungen in der Struktur und Funktion der mikrobiellen Gemeinschaft. Wir liefern konkrete Beweise für den wesentlichen Beitrag von Nicht-Starter-Milchsäurebakterien bei reifungsbezogenen Aktivitäten. Eine Erhöhung der Reifetemperatur förderte die Expression von Genen im Zusammenhang mit Proteolyse, Lipolyse und Aminosäure-/Lipid-Katabolismus und steigerte die Käsereifungsrate deutlich. Darüber hinaus stimmten die temperaturbedingten mikrobiellen Stoffwechselvorgänge mit den Stoffwechselprofilen von Proteinen und flüchtigen organischen Verbindungen im Käse überein. Die Ergebnisse zeigen deutlich, wie verarbeitungsgesteuerte Mikrobiomreaktionen moduliert werden können, um die Produktionseffizienz und Produktqualität zu optimieren.

Käse ist eine biologisch und biochemisch dynamische Matrix, in der die Struktur und Aktivität der Mikrobiota durch Herstellungspraktiken und Umweltbedingungen beeinflusst wird. Traditionelle Käsesorten verwenden entweder natürlich ausgewählte Starterkulturen mit großer genetischer Vielfalt oder verzichten auf Starterkulturen1,2. Daher beherbergen traditionelle Käsesorten eine reichhaltige und komplexe Mikrobiota, die aus der Verwendung undefinierter natürlicher Molkekulturen (NWCs) entsteht, die nach einem Backslopping-Verfahren verwendet werden, aber auch aus Rohmilch und aus der Molkereiumgebung3, deren Rolle bei der Herstellung und Reifung besteht erkannt, aber oft zu wenig erforscht. Die Käseherstellung ist durch eine Abfolge verschiedener Milchsäurebakterienarten (LAB) gekennzeichnet. Die Versauerung des Quarks wird hauptsächlich durch thermophile LAB, hauptsächlich Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii und Lb, vorangetrieben. helveticus2,4,5, während mesophile Non-Starter-LAB (NSLAB) während der Reifung die Rolle übernehmen und an der Entwicklung des Käsegeschmacks und der Käsetextur beteiligt sein können6,7,8,9,10,11. Die Mikrobiota spielt eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der typischen sensorischen Eigenschaften von Käse12,13. Dennoch sind diese komplexen mikrobiellen Konsortien oft schwer zu kontrollieren und ihre Dynamik und Entwicklung während der Käseherstellung und -reifung kann nicht einfach vorhergesagt werden. Das Verständnis des mikrobiellen Verhaltens während der Käsereifung und der Art und Weise, wie die angewandten technologischen Parameter die Dynamik der Käseherstellung und die Qualität des Endprodukts beeinflussen können, sind entscheidende Schritte zur Gewährleistung von Sicherheit und Qualität3,14. Darüber hinaus kann die Beschleunigung der Reifungskinetik durch die Modulation mikrobieller Aktivitäten für traditionelle, kleine und stärker industrialisierte Molkereien äußerst wichtig sein. Mit dieser Steuerung können sie die Betriebskosten senken, den Umsatz der Reifekammern steigern und die Prozesseffizienz optimieren, wobei die Käsequalität im Vordergrund steht. Die Untersuchung der dynamischen mikrobiellen Ökologie und des Stoffwechsels während der Käseherstellung mithilfe multiomischer Ansätze kann zur Verbesserung der Effizienz beitragen14,15. Metatranskriptomik wurde kürzlich zur Untersuchung inokulierter Stammkulturen in Modellkäsen eingesetzt16,17, doch die Transkriptdynamik komplexer Gemeinschaften bleibt unerforscht. Andererseits sind mikrobielle Gemeinschaften fermentierter Lebensmittel nicht so komplex wie jene anderer natürlicher Umgebungen und können ein reproduzierbares und handhabbares System sein, um die Dynamik der mikrobiellen Ansammlung und deren Manipulation durch abiotische Faktoren zu untersuchen18.

Während der Reifung des traditionellen italienischen Caciocavallo Silano-Käses wurde eine Längscharakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur und der Genexpression durchgeführt. Dies ist ein typischer mittelreifer Pasta-Filata-Käse, der unter Zusatz von NWC als natürlichem Starter hergestellt wird. Die hier berichtete erste Untersuchung ergab Parameter, die geändert werden könnten, um die Reifung zu beschleunigen. Daher haben wir ein zweites Experiment durchgeführt, in dem die Reifungsbedingungen moduliert wurden und konsistente Veränderungen in der Struktur und Funktion der mikrobiellen Gemeinschaft beobachtet wurden. Wir zeigen, wie sich eine steigende Reifetemperatur auf den mikrobiellen Stoffwechsel auswirkt, was die Käsereifungsrate deutlich erhöht.

Die Käsereifung wurde in zwei separaten Experimenten untersucht. Zunächst wurden eine Analyse der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur (16S rRNA-Amplikon) und eine oberflächliche Untersuchung der Genexpression (Metatranskriptomik) an roher und thermisierter Kuhmilch, natürlicher Molkekultur, Quark nach 5 Stunden Fermentation und vor dem Strecken, Käse nach dem Salzen und während der Fermentation durchgeführt Reifung nach 0, 10, 20, 30 und 60 Tagen. Auf diese Weise identifizierten wir, welche bakteriellen Aktivitäten/Pfade während der Herstellung und Reifung eines Pasta-Filata-Käses stark ausgeprägt waren, was die notwendigen Parameter lieferte, um zu verstehen, wie die Reifung beschleunigt werden kann.

Anschließend führten wir ein zweites Experiment durch, das das Mikrobiom über 30 Tage hinweg charakterisierte, und zwar für Käse, der unter drei verschiedenen Bedingungen gereift war: (A) Standardbedingungen in der Molkerei (16 °C und 75 % relative Luftfeuchtigkeit), (B) Erhöhung der Temperatur auf 20 °C °C und (C) senken die relative Luftfeuchtigkeit auf 65 %.

Im ersten Experiment haben wir insgesamt 3,3 Gbit/s und im zweiten Experiment 19,8 Gbit/s erhalten. Im ersten Experiment wurden durchschnittlich 876.295 Reads/Probe (±409.657) erhalten und durchschnittlich 22 % der Reads wurden eindeutig den Referenzgenomen zugeordnet (im Bereich von 12 bis 27,8 %).

Im zweiten Experiment erhielten wir durchschnittlich 1.180.7044 Reads/Probe (±5,9 Millionen) und durchschnittlich 35,5 % der Reads, die eindeutig den Referenzgenomen zugeordnet waren (im Bereich von 23,9 bis 58,6 %). Die normalisierte Häufigkeit (Reads pro Million) der für jede Art identifizierten Gene und die relative OTU-Häufigkeit (%) sind in den Ergänzungstabellen S1 und S2 angegeben.

Die Käsereifung wurde durch einige Nicht-Starter-Laktobazillen, z. B. Lb., vorangetrieben. casei und Lb. Buchneri, Gruppen, deren Häufigkeit im Käsekern größer war als in der Kruste. Dieses Ergebnis stimmte in beiden in dieser Studie durchgeführten Experimenten überein. Firmicutes waren der Stamm, der die Kern- und Krustenmikrobiota am deutlichsten differenzierte (ergänzende Abbildung 1). Die mikrobielle Belastung auf MRS-Agar, der bei 30 °C inkubiert wurde, nahm während der Reifung zu, wobei die Werte im Käsekern zunahmen, während thermophile Laktobazillen und Streptokokken zunehmend abnahmen (Ergänzungstabelle 3). Als wir drei verschiedene Reifungsbedingungen verglichen (zweites Experiment), waren NSLAB nach 10 Reifungstagen im Vergleich zu den Kontrollbedingungen deutlich häufiger anzutreffen, wenn die relative Luftfeuchtigkeit reduziert wurde (C–17,2 %) und wenn die Reifungstemperatur erhöht wurde (B–15,3 %). (A–8,3 %) (P < 0,05). Bei reduzierter relativer Luftfeuchtigkeit (C) nahm die NSLAB-Häufigkeit jedoch nach 10 Tagen Reifung rasch ab. Interessanterweise hat Lb. Fermentum, das im Kontrollzustand nicht nachgewiesen wurde, erschien im erhöhten Temperaturzustand (B) nach 10 Tagen und nahm während der Reifung weiter zu.

Die Ergebnisse des ersten Experiments zeigten, dass Quark und Käse nach dem Formen und Salzen durch die Prävalenz von Genen gekennzeichnet waren, die am Kohlenhydratstoffwechsel beteiligt sind. Während der Reifung wurden der Kohlenhydratstoffwechsel (Pentose-Phosphat-Weg, Glykolyse) und die Zellteilung (genetische Informationsverarbeitung und Kernzellprozesse) auf der Käsekruste angereichert, während die Käsekerne durch einen deutlich erhöhten Aminosäure- und Lipidstoffwechsel gekennzeichnet waren (Abb. 1). . Darüber hinaus zeigten Proben, die während des zweiten Experiments bei höherer Temperatur gereift waren (B), einen Anstieg der Expression von Signalwegen im Zusammenhang mit dem Aminosäure- und Lipidstoffwechsel (Abb. 2a) und damit verbundenen Genen (Abb. 2b) im Vergleich zur Kontrolle (A). bei gleichen Reifezeiten. Gene, die mit dem Leloir-Weg des Galaktoseabbaus zusammenhängen, wurden im Vergleich zum Tagatose-6-phosphat-Weg überexprimiert. Enzyme, die für den Laktoseabbau verantwortlich sind (lacZ, EC 3.2.1.23 und lacG, EC 3.2.1.85), Leloir- und Tagatosewege, zeigten maximale Expression in den frühen Stadien der Herstellung und nahmen während der Reifung ab (ergänzende Abbildung 2). Enzyme, die zur Acetoin- und Diacetylproduktion führen, wurden auf der Kruste hochreguliert und zeigten bei höherer Temperatur eine deutlich stärkere Expression (B im Vergleich zu A; ergänzende Abbildung 3). Darüber hinaus wurden eine Reihe von Peptidasen, Aminosäure- und Peptidpermeasen, Lipasen und Genen, die am Aminosäurekatabolismus und der β-Oxidation von Fettsäuren beteiligt sind, im Kern von bei höherer Temperatur gereiftem Käse überexprimiert (Abb. 2b und Ergänzungstabelle 4). . Schließlich steigerte eine höhere Temperatur die Expression von Genen, die an der Biosynthese von Fettsäuren aus Pyruvat beteiligt sind (Abb. 3). Die DESeq-Analyse identifizierte 651 Gene, die unabhängig von der Reifezeit unterschiedlich zwischen den in Zustand A und B gereiften Käsekernen exprimiert wurden (P-Wert <0, 05) (Ergänzungstabelle 4). Darunter waren die Proteasen, Peptidasen, Dipeptidtransporter, Aminosäurepermeasen, Aminosäurekatabolismusgene, Fettsäure-β-Oxidation und Biosynthese im Kern der Proben B im Vergleich zu A überexprimiert (Ergänzungstabelle 4).

Das Metatranskriptom steuert die Trennung von Käsekern und Kruste.

PCA basiert auf der Häufigkeit der KEGG-Annotationen auf Ebene 2 der Hierarchie der Käsekern- und -krustenproben aus dem ersten in dieser Studie durchgeführten Experiment. Die erste Komponente (horizontal) macht 65,7 % der Varianz aus und die zweite Komponente (vertikal) macht 12,2 % aus. CO, Käsekernproben; CR, Proben von Käsekruste.

Höhere Temperaturen fördern die reifungsbedingte Genexpression.

Durchschnittliche Verknüpfungsclusterung von Proben aus dem zweiten Experiment basierend auf dem euklidischen Abstand des Anteils der KEGG-Signalwege (oben) oder Gene (unten), die zum Stoffwechsel von Kohlenhydraten (violett), Aminosäuren (orange) und Lipiden (cyan) gehören. Die Spaltenleiste ist wie folgt farblich gekennzeichnet: Rot, Käse bei t0; blau, unter Standardbedingungen gereifter Käse, grün, bei höherer Temperatur gereifter Käse. Die Farbskala stellt die skalierte Häufigkeit jeder Variablen dar, die als Z-Score bezeichnet wird, wobei Rot eine hohe Häufigkeit und Blau eine geringe Häufigkeit anzeigt. In den Proben-IDs gibt der erste Teil die Reifungszeit an (von t0, Käse nach dem Salzen und Trocknen, bis 30 Tage Reifung); CO, Kern oder CR, Kruste; A, Reifung unter Standardbedingungen; B, höhere Temperatur.

Wege, die zur Produktion von Fettsäuren aus Aminosäuren führen.

Biosynthese von Fettsäuren aus Pyruvat (A) und aus dem Katabolismus verzweigtkettiger Aminosäuren (B). Es werden nur die in den analysierten Proben identifizierten KEGG-Gene gemeldet und ihre Häufigkeit wird im Wärmediagramm (C) angezeigt. Die durchschnittliche Kopplungsclusterung basiert auf der Spearman-Distanz des Anteils der KEGG-Gene. Es werden nur Proben aus dem zweiten Experiment gezeigt. Die Spaltenleiste ist wie folgt farblich gekennzeichnet: Rot, Käse bei t0; Blauschimmelkäse, unter Standardbedingungen gereift; grün, bei höherer Temperatur gereifter Käse. Die Farbskala stellt die skalierte Häufigkeit jeder Variablen dar, die als Z-Score bezeichnet wird, wobei Rot eine hohe Häufigkeit und Blau eine geringe Häufigkeit anzeigt. In den Proben-IDs gibt der erste Teil die Reifungszeit an (von t0, Käse nach dem Salzen und Trocknen, bis 30 Tage Reifung); CO, Kern oder CR, Kruste; A, Reifung unter Standardbedingungen; B, höhere Temperatur. *Malonyl-CoA kann durch Propanoyl-CoA ersetzt werden, was zu ungeradzahligen Fettsäuren führt. **Für jeden Zyklus werden 2 Kohlenstoffatome hinzugefügt.

Die Expression des Aminosäurestoffwechsels war überwiegend mit den Firmicutes verbunden, was auf einen klaren Einfluss der Temperatur auf den Stoffwechsel dieses Stammes schließen lässt (Abb. 4). Insbesondere die Expression des Aminosäurestoffwechsels von Lb. Casei schien unter der erhöhten Temperatur deutlich zuzunehmen. Allerdings zeigten auch andere NSLAB-Taxa (wie Lb. buchneri, Lb. plantarum, Lb. gasseri, Lb. fermentum, Lb. rhamnosus, Leuconostoc kimchii, Leuc. mesenteroides, Leuc. citreum, Pediococcus pentosaceus) eine erhöhte Aktivität des Aminosäurestoffwechsels die höhere Temperatur. Ein Netzwerk, das signifikante (FDR < 0,05) Spearman-Korrelationen zwischen KEGG-Genen, OTUs und Metabolom zeigt, legt eindeutig nahe, dass die Häufigkeit von NSLAB positiv mit Genen korreliert, die am Aminosäure- und Fettsäurestoffwechsel beteiligt sind, sowie der Häufigkeit flüchtiger Verbindungen, der Lipolyse usw Proteolyseindizes (Abb. 5). Darüber hinaus standen die mit der Reifung verbundenen Aktivitäten in umgekehrtem Zusammenhang mit der Häufigkeit von thermophilem LAB aus dem natürlichen Starter (Abb. 5).

Höhere Temperaturen steigern den NSLAB-Aminosäurestoffwechsel.

Taxonomische Zuordnung der zum KEGG-Aminosäurestoffwechsel gehörenden Gene in den Käsekernproben aus dem zweiten Experiment, 30 Tage nach der Reifung. Es werden nur Arten gemeldet, die zu Firmicutes gehören. A, Reifung unter Standardbedingungen; B, höhere Temperatur.

NSLAB-Häufigkeit, reifungsbedingte Genexpression und Metabolom sind eng miteinander verbunden.

Netzwerk, das signifikante (FDR < 0,1) Spearman-Korrelationen zwischen KEGG-Genen, die zum Aminosäure- und Lipidstoffwechsel gehören, VOCs, Lipolyse- und Proteolyseindizes und OTUs, die zu Firmicutes gehören, zeigt, die durch 16S-rRNA-Sequenzierung identifiziert wurden. Die Knotengröße wurde proportional zur Anzahl der signifikanten Korrelationen gemacht. Die Kantenfarbe zeigt negative (blau) oder positive (grau) Korrelationen an. Die Knotenfarbe wurde wie folgt zugewiesen: grün, KEGG-Gene im Zusammenhang mit dem Aminosäurestoffwechsel; rot, KEGG-Gene im Zusammenhang mit dem Lipidstoffwechsel; gelb, VOCs; Magenta, chemische Indizes; Cyan, Firmicutes OTUs.

Die höhere Reifetemperatur förderte auch die Entwicklung von Aromastoffen, sowohl im Käsekern als auch auf der Kruste (Tabelle 1). Die metabolomischen Profile stimmten in hohem Maße mit den Expressionsprofilen aus der metatranskriptomischen Analyse überein. Flüchtige kurzkettige Fettsäuren (Butan-, Pentan-, Hexan-, Heptan-, Oktan- und Decansäure) waren zusammen mit 2-Methylketonen und Alkoholverbindungen wie Hexanol, 2-Heptanol, 1-Butanol und 3-Methylketonen die am häufigsten vorkommenden flüchtigen Verbindungen. Methylbutanol. Methylketone, sekundäre Alkohole und freie Fettsäuren nahmen während der Reifung reichlich zu und waren bei der höheren Temperatur erhöht, was auch für 3-Methylbutanol beobachtet wurde (P < 0,05). Freie Fettsäuren können durch direkte Lipolyse von Triacylglycerinen entstehen oder ex novo aus Pyruvat synthetisiert werden, das beim Abbau von Aminosäuren entsteht (Abb. 3). Die Lipolyse- und Proteolyseindizes waren im Kern höher und stiegen bei Käse, der bei höherer Temperatur gereift war (Tabelle 1). Dementsprechend zeigte die LC/MS-Analyse der bei einem pH-Wert von 4,6 unlöslichen Stickstofffraktion einen umfassenden Abbau von αs1- und β-Casein in dem bei höherer Temperatur gereiften Käse, während die bei einem pH-Wert von 4,6 lösliche Fraktion eine größere Menge an löslichen Peptiden aufwies, die von dieser stammen zwei Proteine (ergänzende Abbildung 4).

Der Käsereifungsprozess ist sehr komplex und beinhaltet mikrobiologische und biochemische Veränderungen, die zur Entwicklung eines bestimmten Geschmacks und einer bestimmten Textur führen. Das Käsemikrobiom wird durch die abiotischen Faktoren geprägt, die während der Reifung auftreten (pH-Wert, aw, NaCl-Konzentration, O2-Verfügbarkeit). Aufgrund der unterschiedlichen Umgebungsbedingungen kann es daher zu unterschiedlichen Dynamiken im Käsekern und in der Käsekruste kommen3,19. Die Bedeutung pilz- und bakterienassoziierter Stoffwechselaktivitäten in oberflächengereiften Käsesorten wurde kürzlich hervorgehoben16,17,20, während zuvor ein Anstieg des NSLAB in gereiften Käsesorten beobachtet wurde7,10. NSLAB sind als proteolytisch bekannt21,22,23 und der Zusatz ausgewählter Kulturen steigert nachweislich den Proteolysegrad8,24,25, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise eine Schlüsselrolle bei der Käsereifung spielen. Wir liefern konkrete Beweise für ihren wesentlichen Beitrag und zeigen, dass sich im Käsekern und in der Käsekruste eine unterschiedliche Struktur und Funktionalität des Mikrobioms entwickelt und dass die Reifung mit einem Gradienten vom Kern zur Kruste verläuft, angetrieben durch die NSLAB-Sukzession. Auf der Käseoberfläche, wo niedrigere aw- und höhere O2-Konzentrationen die Umgebung beeinträchtigen, verzögert sich die NSLAB-Entwicklung und der Zellstoffwechsel ist auf die Vermehrung und Energieproduktion aus Kohlenhydraten ausgerichtet. Konsequenterweise wurden der Laktoseabbau und der Galaktosestoffwechsel auf der Käsekruste verzögert und ihre Konzentrationen blieben auf der Kruste im Vergleich zum Kern konstant höher. Darüber hinaus werden die mikrobiellen Aktivitäten stark von den Bedingungen während der Reifung beeinflusst. Wir können die höheren Proteolysewerte nicht ausschließlich mit der bakteriellen Aktivität in Verbindung bringen, und endogene Enzyme könnten im Käse auch ohne einen Schritt des Quarkkochens noch aktiv sein. Ein eindeutiger bakterieller Beitrag zu den Reifungsaktivitäten wird jedoch durch die Konsistenz zwischen Metatranskriptom- und Metabolomdaten und durch den signifikanten Grad der Korrelation zwischen dem Auftreten von NSLAB, Expressionsprofilen und Stoffwechselmustern gestützt (Abb. 5). Insbesondere ist die bakterielle Genexpression reifungsassoziierter Aktivitäten maßgeblich mit Metabolitenprofilen sowie Proteolyse- und Lipolyseindizes verknüpft.

Der durch die höhere Temperatur verstärkte Anstieg der Proteolyse, Lipolyse und des Abbaus von Aminosäuren/Fettsäuren förderte definitiv die Produktion flüchtiger Verbindungen. Die beobachteten freien Fettsäuren können durch direkte Lipolyse von Triacylglycerinen sowie durch Ex-novo-Biosynthese aus Pyruvat entstehen, das durch Aminosäurekatabolismus entsteht26. Darüber hinaus entsteht 3-Methylbutanol durch Leucinabbau und Methylketone und sekundäre Alkohole entstehen durch den Abbau von Fettsäuren27,28.

Kürzlich wurde die Bedeutung der Erforschung mikrobieller Zusammenbaumechanismen in fermentierten Lebensmitteln (MCoFFs) hervorgehoben18. Fermentierte Lebensmittel bieten verlockende Möglichkeiten, mikrobielle Stoffwechselmuster und ökologische Dynamiken zu untersuchen, die Haupttreiber zu identifizieren und Hypothesen zu testen, die leicht auf komplexere Umgebungen übertragen werden können18. Wir geben ein klares Beispiel dafür, wie sie verwendet werden könnten, um die Wirkung abiotischer Faktoren auf den Aufbau und den Stoffwechsel mikrobieller Gemeinschaften zu verstehen. Dies unterstützt das Potenzial zur Modellierung der Dynamik mikrobieller Gemeinschaften in komplexeren Umgebungen18.

Die Erhöhung der Reifungstemperatur fördert die Expression von Genen, die mit der Proteolyse und dem Transport und Katabolismus von Aminosäuren/Lipiden zusammenhängen, was zu einer höheren Konzentration an freien Aminosäuren und Fettsäuren führt und die Produktion von VOC steigert, die typischerweise in Caciocavallo-Käse-Volatilome7 vorkommt, was möglicherweise die Entwicklung beschleunigt Reifung und Verstärkung der potenziellen Geschmackswirkung des Käses. Tatsächlich wiesen Käse, die nur 20 Tage bei höherer Temperatur gereift waren, sehr ähnliche transkriptomische Profile auf wie Käse, die länger bei Standardtemperatur gereift waren, was darauf hindeutet, dass die reifungsbedingte Aktivität durch die Änderung der Reifungsbedingungen verstärkt wird. Schließlich bestätigte die taxonomische Zuordnung von Genen im Zusammenhang mit den KEGG-Aminosäurestoffwechselwegen eine Verschiebung im Aminosäurestoffwechsel aufgrund der höheren Temperatur und betonte die Rolle von NSLAB als grundlegende Akteure bei der Käsereifung.

Die Ergebnisse zeigen deutlich, wie wichtig Änderungen der Reifungsbedingungen für die Manipulation des Käsemikrobioms und seiner Aktivitäten sind und dass die Reaktion des Mikrobioms umgehend zur Verbesserung der Verarbeitungsbedingungen und der Produktqualität genutzt werden kann.

Die Herstellung und Reifung des Käses erfolgte in einer Molkerei in Süditalien, in der Caciocavallo Silano-Käse hergestellt wird, der die geschützte Ursprungsbezeichnung (gU, EG-Verordnung 1263/96) trägt. In einem ersten Experiment wurden rohe und thermisierte Kuhmilch, NWC, Quark nach 5 Stunden Fermentation und vor dem Strecken (wenn der pH-Wert ca. 5,25 erreichte), Käse nach dem Formen, nach dem Salzen und während der Reifung (bei 10, 20, 30 und 60) untersucht Tage) wurden gesammelt und durch 16S-rRNA-Sequenzierung und RNA-Seq analysiert (Ergänzungstabelle 5). Um in einem zweiten Experiment die Wirkung der Reifungsparameter auf das Mikrobiom zu bewerten, entschieden wir uns, die Käse aus derselben Herstellung unter drei verschiedenen Bedingungen zu reifen: einer Kontrollreifung (A) unter Verwendung der Standardbedingungen in der Molkerei (16 °C). C und 75 % RH, Bedingung A), Erhöhung der Temperatur auf 20 °C (B) oder Senkung der RH auf 65 % (C). In diesem zweiten Experiment wurden die gereiften Käsesorten bis zu 30 Tage lang gesammelt. Die in der Ergänzungstabelle 5 sowie im gesamten Text und in den Abbildungen angegebenen Proben-IDs wurden wie folgt zugewiesen: Der erste Teil der ID gibt den Zeitpunkt der Reifung an (von t0, Käse nach dem Salzen und Trocknen, bis 60 Tage Reifung); CO, Kern oder CR, Kruste; A, Reifung unter Standardbedingungen, B, Reifung bei höherer Temperatur, C, Reifung bei niedrigerer relativer Luftfeuchtigkeit.

Die Wasseraktivität (aw) wurde mit einem HygroPalm23-AW-Gerät (Rotronic AG, Basserdorf) gemessen.

Proben aus dem Kern (der innere Teil, der in der Mitte des Käses gesammelt wird) und der Kruste (der äußere Teil, nach dem Abziehen der äußeren Schicht) wurden unter sterilen Bedingungen geschnitten (in etwa 0,5 cm dicke Scheiben) und separat analysiert. Von jeder Probe wurden verschiedene Aliquots für die verschiedenen Analysen in sterilen Plastiktüten gesammelt und unter gekühlten Bedingungen (4 °C) ins Labor transportiert. RNAlater (Ambion, Foster City, Kalifornien) wurde im Verhältnis 1:6 zu dem Aliquot hinzugefügt, das für die RNA-Extraktion vor dem Transport verwendet werden sollte. Die Proben wurden vor der Analyse bei –80 °C gelagert, mit Ausnahme der Mikrobenzählung, die innerhalb von 2 Stunden nach der Probenahme wie folgt durchgeführt wurde.

25 Gramm (fest) oder 25 ml (flüssig) der Probe wurden zu jedem Zeitpunkt der Probenahme und unter jeder Reifungsbedingungen in 225 ml viertelstarker Ringer-Lösung (Oxoid, Mailand, Italien) 2 Minuten lang in einem Stomacher homogenisiert ( LAB Blender 400) unter Verwendung von Sto-Circul-Bag Stomacherbeuteln (beide von PBI, Mailand, Italien) bei Raumtemperatur. Es wurden Dezimalverdünnungen in viertelstarker Ringer-Lösung hergestellt und 1-ml-Aliquots der entsprechenden Verdünnungen dreifach in M17- oder MRS-Agar (Oxoid, Mailand, Italien) beimpft und 48 Tage lang aerob und anaerob bei 30 bzw. 42 °C inkubiert h, um die Lebendzahl mesophiler und thermophiler Streptokokken oder Laktobazillen zu ermitteln. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert der logarithmischen Koloniebildenden Einheiten (KBE)/g für drei unabhängige Bestimmungen berechnet.

Später in RNA gelagerte Proben wurden homogenisiert und 10 ml der Mischung wurden 10 Minuten lang bei 4 °C (12.000 × g) zentrifugiert. Zwei biologische Replikate (zwei verschiedene Käsesorten an jedem Probenahmepunkt und für jede Bedingung) wurden einer RNA-Extraktion unterzogen und die Gesamt-RNA wurde vor der weiteren Verarbeitung gepoolt. Das Pellet wurde zweimal in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4) gewaschen und die RNA-Extraktion wurde im Doppel unter Verwendung des PowerMicrobiome RNA Isolation Kit (MoBio, Carlsbad, Kalifornien) durchgeführt. Die DNA wurde durch eine 3-stündige Behandlung mit TURBO-DNase (Ambion, Foster City, Kalifornien) bei 37 ° C entfernt. Das Fehlen von DNA wurde mittels PCR überprüft und die Behandlung bei Bedarf wiederholt. Die Qualität der RNA wurde durch Agarosegelelektrophorese und mit dem 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, Kalifornien) überprüft. Zur Quantifizierung wurden das Qubit und das Qubit RNA Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien) verwendet.

Komplementäre DNA (cDNA) wurde unter Verwendung des High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornien) ausgehend von 200 ng Gesamt-RNA synthetisiert. Die mikrobielle Diversität wurde durch Pyrosequenzierung der amplifizierten V1–V3-Region der 16S-rRNA untersucht, wie an anderer Stelle berichtet29. PCR-Bedingungen, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung wurden wie kürzlich beschrieben durchgeführt30.

Das Metatranskriptom wurde für alle Proben des ersten Experiments und für ausgewählte Proben des zweiten Experiments untersucht (Ergänzungstabelle 3). Für alle Proben wurden zwei Replikate sequenziert (jedes Replikat wurde durch Zusammenführen der aus zwei verschiedenen Käsesorten extrahierten RNA erhalten). Ribosomale RNA (rRNA) wurde mit dem Ribo-Zero Magnetic Kit (Epicentre, Charlotte, North Carolina) abgereichert und die mit mRNA angereicherte RNA wurde mit Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter, Mailand, Italien) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Anschließend wurden die Bibliotheksvorbereitung und das Probenmultiplexing unter Verwendung des ScriptSeq v2 RNA-Seq Library Prepared Kit (Epicentre, Charlotte, North Carolina) (Einsatzgröße ca. 300 bp) durchgeführt. Die Qualität der Bibliothek wurde mit 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, Kalifornien) überprüft. Die Sequenzierung wurde auf einem Next Seq 500 Sequencer mit dem Mid Output Kit (beide von Illumina, San Diego, Kalifornien) durchgeführt und ergab Single-End-Reads mit 150 bp.

16S-rRNA-Amplikon-Reads wurden mit der Software QIIME 1.9.031 analysiert, wie bereits berichtet30. OTUs, die durch eine Ähnlichkeit von 99 % definiert waren, wurden mithilfe der uclust-Pipeline32 ausgewählt und die repräsentativen Sequenzen wurden an den RDPII-Klassifikator33 übermittelt, um die Taxonomiezuordnung und die relative Häufigkeit jeder OTU mithilfe der Greengenes 16S rRNA-Gendatenbank34 zu erhalten.

Die gesamte Metatranskriptomdatenanalyse wurde wie folgt durchgeführt: Die Qualität der Rohlesevorgänge (Phred-Scores) wurde mithilfe des FastQC-Toolkits (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) bewertet. Die Kontamination von Adapter und Primer wurde mit CutAdapt35 eliminiert. Anschließend wurden Basen mit geringer Qualität (Phred-Score <20) gekürzt und Lesevorgänge, die kürzer als 60 bp waren, mit der SolexaQA++-Software verworfen36. Die Lesevorgänge wurden mithilfe von Bowtie237 im durchgängigen, sensiblen Modus an einer Referenzdatenbank ausgerichtet. Die verwendete Datenbank wurde durch Herunterladen der proteinkodierenden Teile des Genoms (.ffn-Dateien) aus der NCBI RefSeq-Datenbank (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ASSEMBLY_BACTERIA/) und von http://patricbrc erstellt .org/portal/. Die eingeschlossenen Arten wurden gemäß den Ergebnissen der 16S-Sequenzierung und der Auswahl von Arten ausgewählt, die häufig in Nahrungsökosystemen vorkommen (aufgelistet in der Ergänzungstabelle 6). Da wir keine Metagenomik durchgeführt haben und die Genome der Stämme nicht direkt aus diesen Proben isoliert wurden, wurden alle verfügbaren sequenzierten Genome einbezogen. Die verketteten .ffn-Dateien wurden mithilfe von mblastx39 mit der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Datenbank38, Version April 2011, abgeglichen, um die funktionale Annotation und die Gentaxonomie zu erhalten. Die Anzahl der Lesevorgänge, die jedem Gen in der Datenbank eindeutig zugeordnet sind, wurde mithilfe von SAMtools40 extrahiert und mithilfe benutzerdefinierter Skripts, die in der R-Umgebung erstellt wurden (www.r-project.org), entsprechend der Bibliotheksgröße normalisiert. Für nachfolgende Analysen wurden nur Gene aufbewahrt, denen mindestens 5 Lesevorgänge/Probe zugeordnet waren. Statistische Analysen und Darstellungen wurden in der R-Umgebung durchgeführt. Die Analyse der differentiellen Genexpression wurde mit dem Bioconductor-Paket DESeq41 durchgeführt. Die P-Werte wurden für mehrere Tests mithilfe des Benjamini-Hochberg-Verfahrens42 angepasst und eine Falscherkennungsrate (FDR) <0,05 wurde als signifikant angesehen. Paarweise Spearman-Korrelationen zwischen OTUs, KEGG-Genen, flüchtigen organischen Verbindungen und biochemischen Indizes wurden mit dem R-Paket psych berechnet und die signifikanten (FDR < 0,05) wurden in einem Korrelationsnetzwerk mit Cytoscape v. 2.8.143 dargestellt. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und das hierarchische Clustering wurden unter Verwendung des made4-Pakets in R durchgeführt. Alle Ergebnisse werden als Mittelwerte von zwei Replikaten angegeben.

Die Extraktion flüchtiger Verbindungen erfolgte nach Lee et al.44. Der gefrorene Käse wurde fein gerieben und 25 g wurden in eine 100-ml-Flasche mit 25 ml entionisiertem Wasser und 50 μl 2-Methyl-3-heptenon (99 % Reinheit, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) als Innenfutter überführt Standard (950 mg L−1) und 12,5 g Natriumphosphat (NaH2PO4). Die Flasche wurde 10 Minuten lang in einem Wasserbad bei 50 °C gehalten, um den Käse zu schmelzen. Anschließend wurde der geschmolzene Käse 20 Minuten lang bei 50 °C magnetisch gerührt, um das Gleichgewicht der flüchtigen Verbindungen im Kopfraum zu beschleunigen. Die SPME-Faser (50/30 μm dickes Divinylbenzol/Carboxen/Polydimethylsiloxan, 2 cm; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) wurde durch ein Teflon-Septum in die Flasche eingeführt und 30 Minuten lang bei 40 °C dem Probenraum ausgesetzt C während des Rührens. Es wurde berichtet, dass derselbe Ballaststofftyp für die Aromaanalyse von Käse äußerst effizient ist45. Flüchtige Verbindungen wurden durch GC in Verbindung mit einem Massenspektrometer unter Verwendung eines GC/MS Hewlett-Packard 6890N (Agilent Technologies, Palo Alto, Kalifornien) analysiert, das mit einer J&W HP-5MS-Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm ID × 0, 25 μm Filmdicke; J&W Scientific, Folsom, Kalifornien). Die Temperatur wurde 2 Minuten lang auf 40 °C eingestellt und mit einer Geschwindigkeit von 6 °C/Minute von 40 auf 160 °C und mit 10 °C/Minute von 160 auf 210 °C/Minute erhöht. Der Injektor wurde auf 250 °C gehalten. Als Trägergas wurde Helium verwendet (0,9 mL min−1). Massenspektren wurden bei 70 eV aufgenommen. Die Quellentemperatur betrug 230 °C und die Grenzflächentemperatur 250 °C. Die thermische Desorption flüchtiger Verbindungen wurde durchgeführt, indem die SPME-Faser 10 Minuten lang im Injektor exponiert wurde. Die Identifizierung der Verbindungen erfolgte durch Vergleich der Retentionszeiten und Massenspektren mit denen reiner Referenzverbindungen unter denselben Bedingungen und mit denen der NIST-Datenbank. Vor der Verwendung wurde die Faser 1 Stunde lang bei 270 °C konditioniert. Vor jeder Analyse wurde ein Blindtest durchgeführt, um die Freisetzung unerwünschter Verbindungen zu verhindern. Die quantitative Analyse wurde durchgeführt, indem die Peakfläche jeder Verbindung in Bezug auf die Peakfläche des internen Standards normalisiert wurde. Peakflächen wurden mit der Software Chemstation (Agilent Technologies, Palo Alto, Kalifornien) verarbeitet. Die Analyse wurde dreifach durchgeführt.

Signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Proben wurden für jede Verbindung durch statistische Einweg-ANOVA-Analyse ermittelt. Zur Unterscheidung der Mittelwerte der Variablen wurde der Tukey-Test verwendet. Unterschiede mit P < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Die Datenausarbeitung erfolgte mit XLStat (Version 2009.03.02), einem Add-in-Softwarepaket für Microsoft Excel (Addinsoft Corp., Paris, Frankreich).

Geriebener Käse (5 g) wurde in 100 ml 0,4 M Natriumcitratpuffer (pH 8,0) dispergiert, zuvor auf 40 °C erhitzt und 1 Minute lang mit einem Ultra-Turrax-Gerät (Ultra-Turrax Modell T25, Ika Labortechnik, Staufen, Deutschland) homogenisiert ). Der Hydrolysegrad (DH) wurde mit der 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure-Methode nach Hermanson46 mit den von Picariello et al.47 berichteten Modifikationen bestimmt. Für die LC-MS-Analyse wurde der pH-Wert der citratlöslichen Fraktion auf 4,6 eingestellt. Die resultierende Suspension wurde 10 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert, die Fettschicht entfernt und die unlöslichen und löslichen Fraktionen getrennt. Die beiden Fraktionen wurden dann mittels LC/ESI-Q/TOF MS/MS unter Verwendung eines Q TOF Ultima Hybrid-Massenspektrometers (Waters, Manchester, UK) analysiert, das mit einer ESI-Quelle ausgestattet war und im Positivionenmodus arbeitete, wie bereits berichtet48.

Der Lipolyseindex wurde als die Menge an KOH (in mg) ausgedrückt, die erforderlich ist, um die in 1 g Probe enthaltenen freien Fettsäuren zu neutralisieren. Zwanzig Gramm jeder gefrorenen Probe wurden fein gerieben und drei Gramm des geriebenen Käses wurden 30 Minuten lang mit 50 ml Ethanol/Diethylether (1:1 v/v) unter Rühren inkubiert, um das Fett zu extrahieren. Die Suspension wurde durch Watman-Papier Nr. 42 filtriert und der Säuregehalt des Filtrats wurde durch Titration gemessen, wie von Dugat-Bony et al.16 beschrieben. Jede Probe wurde dreifach analysiert.

Die 16S-rRNA- und Metatranskriptomsequenzen sind im Sequence Read Archive (SRA) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter den Zugangsnummern SRP061555 bzw. SRP061556 verfügbar.

Zitierweise für diesen Artikel: De Filippis, F. et al. Metatranskriptomik deckt temperaturbedingte funktionelle Veränderungen im Mikrobiom auf, die sich auf die Käsereifungsrate auswirken. Wissenschaft. Rep. 6, 21871; doi: 10.1038/srep21871 (2016).

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FDF wurde durch einen Zuschuss der Regione Campania im Rahmen des Programms „POR CAMPANIA FSE 2007/2013“ unterstützt – Projekt CARINA (Sicherheit, Nachhaltigkeit und Wettbewerbsfähigkeit der Agrar- und Lebensmittelproduktion in Kampanien) – CUP B25B09000080007. Wir danken der Molkerei Campolongo Srl, Montesano Sulla Marcellana – Italien für die Bereitstellung der Proben für diese Studie.

Abteilung für Agrarwissenschaften, Universität Neapel Federico II, Via Università 100, Portici, 80055, Italien

Francesca De Filippis, Alessandro Genovese, Pasquale Ferranti und Danilo Ercolini

Abteilung für Biowissenschaften (BIO), Argonne National Laboratory, Argonne, IL, USA

Jack A. Gilbert

Abteilung für Ökologie und Evolution, University of Chicago, Chicago, IL, USA

Jack A. Gilbert

Abteilung für Chirurgie, University of Chicago, Chicago, IL, USA

Jack A. Gilbert

Institut für Genom- und Systembiologie, University of Chicago, Chicago, IL, USA

Jack A. Gilbert

Das Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, USA

Jack A. Gilbert

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FDF führte die 16S- und Metatranskriptomik-Experimente sowie die Datenanalyse durch und verfasste das Manuskript. DE entwarf die Studie und trug zur Manuskripterstellung bei. JAG trug zur Datenanalyse und Manuskripterstellung bei. AG und PF führten die Analyse des Metaboloms durch.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Dieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nichts anderes angegeben ist; Wenn das Material nicht unter der Creative-Commons-Lizenz enthalten ist, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Nachdrucke und Genehmigungen

De Filippis, F., Genovese, A., Ferranti, P. et al. Metatranskriptomik deckt temperaturbedingte funktionelle Veränderungen im Mikrobiom auf, die sich auf die Käsereifungsrate auswirken. Sci Rep 6, 21871 (2016). https://doi.org/10.1038/srep21871

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Eingegangen: 22. Oktober 2015

Angenommen: 2. Februar 2016

Veröffentlicht: 25. Februar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21871

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