Mechanosensitive Extrusion des Enterovirus A71

Nature Microbiology Band 8, Seiten 629–639 (2023)Diesen Artikel zitieren

2932 Zugriffe

14 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Das Enterovirus A71 verursacht bei einer systemischen Infektion schwere Erkrankungen, die manchmal zu lebensbedrohlichen neurologischen Funktionsstörungen führen. In den meisten Fällen verläuft die Infektion jedoch asymptomatisch und beschränkt sich auf den Magen-Darm-Trakt, wo das Virus für die Übertragung verstärkt wird. Es wurde zuvor gezeigt, dass Picornaviren infizierte Zellen entweder durch Zelllyse oder durch Sekretion von Vesikeln verlassen. Hier berichten wir, dass ganze mit Enterovirus A71 infizierte Zellen spezifisch aus der apikalen Oberfläche differenzierter menschlicher Dickdarmorganoide extrudiert werden, wie durch konfokale Mikroskopie beobachtet. Die unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber chemischen und peptidischen Inhibitoren zeigte, dass die Extrusion virusinfizierter Zellen eher von der Krafterfassung über mechanosensitive Ionenkanäle als vom apoptotischen Zelltod abhängt. Bei Isolierung und Verwendung als Inokulum können intakte virushaltige extrudierte Zellen neue Infektionen auslösen. Im Gegensatz dazu werden große Mengen freier Viren freigesetzt, wenn die mechanische Krafterkennung gehemmt wird. Daher dürfte die Extrusion lebender, virusinfizierter Zellen aus intaktem Epithelgewebe sowohl der Integrität des Wirtsgewebes als auch der geschützten Ausbreitung dieses fäkal-oralen Krankheitserregers innerhalb und zwischen Wirten zugute kommen.

Die Frage, wie Nachkommenviren eine infizierte Zelle oder ein infiziertes Gewebe verlassen, ist für unser Verständnis der Virusausbreitung in einem infizierten Wirt und zwischen Wirten von entscheidender Bedeutung. Jahrzehntelang ging man davon aus, dass Picornaviren als unbehüllte oder „nackte“ Viren streng lytisch übertragen werden, d. h. durch dramatisches Aufbrechen der infizierten Zelle. Die lytische Freisetzung von Picornaviren aus Standard-Gewebekulturzelllinien führt zu einer weitreichenden Verbreitung von Virionen, um nachfolgende Infektionsrunden einzuleiten. Für mehrere Picornaviren wurde jedoch eine nicht-lytische Ausbreitung nachgewiesen, bei der sich die Viren intrazelluläre Membranen aneignen, um ihre Freisetzung aus intakten Zellen zu erleichtern, die in extrazellulären Vesikeln verborgen sind1,2,3,4. Eine Konsequenz dieser Übertragungsstrategie besteht darin, dass Viren nicht dispersiv, sondern einheitlich innerhalb von Membranpaketen übertragen werden5.

Epithelorganoidmodelle sind spannende Werkzeuge zur Untersuchung gewebespezifischer Reaktionen auf pathogene Angriffe6,7. Aus erwachsenen Stammzellen gewonnene dreidimensionale kugelförmige Organoide können differenziert werden, um die Vielfalt der in nativen Geweben vorhandenen Zelltypen nachzubilden8. Organoide wachsen typischerweise so, dass ihre apikalen Oberflächen den inneren Lumenkompartimenten zugewandt sind. 2D-polarisierte Monoschichten oder Organoide, die mechanisch geschert wurden, um den apikalen Zugang des Enterovirus A71 (EV-A71) zu ermöglichen, wurden zur Modellierung einer EV-A71-Infektion des Magen-Darm-Epithels verwendet9,10,11. Kürzlich wurden Methoden zur Umkehrung der Organoidtopologie entwickelt, um die apikale Oberfläche von Magen-Darm-Epithelien direkt den Darmpathogenen zu präsentieren und gleichzeitig die Integrität des Epithels zu bewahren12,13. In diesem Artikel werden diese apikalen Organoide verwendet, um die Infektion von Epithelzellen durch EV-A71 und die nachfolgenden Mechanismen der Virusausbreitung in diesem Gewebe zu überwachen.

Wir waren daran interessiert, apikal nach außen gerichtete gastrointestinale Epithelorganoide als Modell einer EV-A71-Infektion zu verwenden, bei der die Integrität der Epithelbarriere erhalten bleibt. Aufgrund der Nähe des Dickdarms zum Virusaustritt eines infizierten Wirts haben wir uns für die Verwendung von aus Dickdarmgewebe gewonnenen Organoiden (Kolonoiden) entschieden, um die Übertragung von EV-A71 besser zu verstehen. Kolonoide aus erwachsenem menschlichem Kryptagewebe wurden in Gegenwart von Stammfaktoren, einschließlich WNT und R-Spondin, auf Basalmembrangerüsten gezüchtet, wodurch Sphäroide aus Stammzellen entstanden, deren basolaterale Oberfläche nach außen und deren lumenale, apikale Oberfläche nach innen zeigte. Fünf Tage vor der Infektion wurden Kolonoide aus dem Basalmembrangerüst entfernt und in Suspensionskultur ohne Matrix gehalten, um die Umkehr der Organoidtopologie zu induzieren, sodass sich die apikalen Oberflächen auf der Außenseite des Organoids befanden (apikal nach außen)12. Gleichzeitig wurde Medium zur Induktion der Zelldifferenzierung aufgetragen. In diesen apikalen menschlichen Kolonoiden haben wir die Organisation des Aktin-Zytoskeletts und des EV-A71-Rezeptors SCARB2 überwacht (Abb. 1a). Die apikale Oberfläche gut differenzierter und polarisierter Kolonoide enthält Mikrovilli am Bürstensaum, die mit der F-Aktin-Färbung leicht als dicke, aktinreiche Schicht erkennbar sind. SCARB2 ist ein integrales lysosomales Membranprotein, das zur apikalen Oberfläche polarisierter Monoschichten 14, 15 wandert und in diesen apikal nach außen gerichteten Kolonoiden reichlich exprimiert wurde (Abb. 1a).

a: Apikal nach außen gerichtete, differenzierte Kolonepithelorganoide exprimieren den EV-A71-Rezeptor SCARB2 (rot), der sich in intrazellulären Membranen lokalisiert. Die Integrität des apikalen Aktin-Mikrovillus-Bürstenrandes (weiß) ist sichtbar. b: Dickdarmorganoide wurden mit EV-A71 infiziert. Die Virustiter wurden über die Zeit mittels Plaque-Assay überwacht. Dargestellt sind Daten aus vier unabhängigen Experimenten mit zwei verschiedenen Kolonoidspendern. c: EV-A71-infizierte Zellen wurden durch einen Immunfluoreszenztest nach Anfärbung auf doppelsträngige vRNA nach 48 Stunden Infektion beobachtet. Rechts: Erhöhte Vergrößerung der infizierten Zelle, gekennzeichnet durch die gelbe Pfeilspitze im linken Feld. Maßstabsbalken, 10 μm.

Quelldaten

Unmittelbar nach der Infektion beginnende Viruswachstumskurven zeigten, dass EV-A71 differenzierte apikale Kolonoide von zwei verschiedenen menschlichen Spendern produktiv infizieren konnte, wobei die Virusakkumulation in der Kultur bis zu 48 Stunden nach der Infektion anhielt (Abb. 1b). Zu diesem Zeitpunkt wurden infizierte Kolonoide fixiert, gefärbt und mittels konfokaler Mikroskopie auf das Vorhandensein doppelsträngiger viraler RNA (vRNA) untersucht, die nach der Fixierung in infizierten Zellen sichtbar ist, um vRNA-Replikationskomplexe zu identifizieren. Punktförmige nebeneinanderliegende und zytoplasmatische Färbungsmuster, die auf vRNA-Replikationskomplexe hinweisen, konnten leicht beobachtet werden (Abb. 1c). Merkwürdigerweise befanden sich die meisten infizierten Zellen einzeln inmitten ihrer nicht infizierten Nachbarn.

Das Fehlen einer beobachtbaren Virusausbreitung, obwohl die Virusausbeute zunahm, konnte durch sorgfältige Inspektion der apikalen Oberflächen der infizierten Kolonoiden erklärt werden. Wir waren überrascht über die häufige Beobachtung von virusinfizierten Zellen, die scheinbar aus intakten Kolonoiden extrudierten (Abb. 2a–c). In gesunden Magen-Darm-Epithelien sorgt die Ganzzellextrusion für die Aufrechterhaltung der homöostatischen Zellzahl, indem die Entfernung vorhandener Zellen erleichtert wird, um sie an die Geschwindigkeit der Stammzellexpansion in den Krypten anzupassen. Tatsächlich werden so viele Zellen extrudiert, dass die durchschnittliche Lebensdauer einer Magen-Darm-Epithelzelle nur 2–5 Tage beträgt16,17. Um festzustellen, ob die Häufigkeit der Extrusion von EV-A71-infizierten Zellen die von nicht infizierten Zellen überstieg, haben wir quantifiziert, wie häufig sowohl infizierte als auch nicht infizierte Zellen aus denselben EV-A71-infizierten Kolonoiden extrudiert wurden (Abb. 2d, e und Ergänzungstabelle 1). ). Infizierte Kolonoide wurden fixiert, gefärbt und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Einzelne Zellen wurden in (1) infiziert oder nicht infiziert und (2) extrudierend oder nicht extrudierend kategorisiert. Eine Zelle wurde als aus einem Organoid heraustretend definiert, wenn ihr Zellkern die apikale Grenze des Organoids überschritten hatte, was durch Anfärben des kortikalen Aktins mit Phalloidin sichtbar gemacht wurde. Zum untersuchten 48-Stunden-Zeitpunkt extrudierten 40 % der infizierten Zellen, verglichen mit nur 1 % der nicht infizierten Zellen (Abb. 2d und Ergänzungstabelle 1). Auch wenn infizierte Zellen nur 0,4 % der Zellen innerhalb der Organoide ausmachten, machten sie 25 % der extrudierten Zellen aus (Abb. 2e und Ergänzungstabelle 1). Diese Daten zeigen, dass infizierte Zellen mit deutlich höheren Frequenzen aus Kolonoiden austreten, als durch Zufall erwartet.

a–c: Infizierte Kolonoide wurden 48 Stunden nach der Infektion fixiert und auf doppelsträngige vRNA gefärbt. d, Infizierte Zellen wurden häufiger aus Kolonoiden extrudiert als nicht infizierte Zellen. Der Prozentsatz infizierter oder nicht infizierter Zellen, die aus einem einzelnen Organoid extrudieren, wird als kleine Kreise angezeigt. Der Anteil der Zellen, die in jedem Experiment über alle Organoide extrudiert werden, wird als Dreiecke in der gleichen Farbe wie die einzelnen Kolonoiden angezeigt. Pro Experiment wurden mindestens zehn Organoide quantifiziert: **P < 0,01; gepaarter, zweiseitiger t-Test, N = 3 Experimente. e, Prozentsätze infizierter extrudierender und nicht extrudierender Zellen wurden auf ähnliche Weise gemessen. Von den extrudierten Zellen war ein höherer Prozentsatz infiziert. **P < 0,01; Einfaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen und Tukeys Mehrfachvergleichstest, N = 3 Experimente. In d und e sind die in den Diagrammen dargestellten Rohzellzahlen in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. f: EV-A71-infizierte Kolonoide wurden auf Muc2-Expression, einen Marker für Becherzellen, gefärbt. Die Pfeilspitze zeigt eine infizierte Zelle an. Der Pfeil zeigt die in g dargestellte Becherzelle an. g: Muc2-exprimierende Becherzelle. h,i, Villin-Expression identifiziert Kolonozyten. Villin ist apikal lokalisiert und überlappt mit dem aktinreichen Mikrovillus-Bürstensaum. Es werden deutliche Einzelzellen dargestellt. j,k, EV-A71-infizierte Kolonoide wurden auf Villin-Expression gefärbt. l, Es werden repräsentative extrudierende infizierte Zellen gezeigt. m, Dargestellt sind Stadien der kanonischen Zellextrusion in nicht infizierten Epithelien. n,o, Mit Poliovirus Typ 1 (Mahoney) infizierte Zellen wurden durch Immunfluoreszenz beim Extrudieren aus Ileumorganoiden beobachtet. o zeigt eine einzelne Zelle, die in n hervorgehoben ist. Maßstabsbalken, 10 μm. In d und e stellen die horizontalen Balken und die Fehlerbalken den Mittelwert ± Standardabweichung dar

Quelldaten

Um den permissiven Zelltyp in den Kolonoiden zu identifizieren, führten wir eine Immunfärbung mit Antikörpern gegen Villin1 und Muc2 durch, die von absorbierenden Kolonozyten bzw. Becherzellen exprimiert werden (Abb. 2f – k). Beide Zelltypen waren zuvor an einer EV-A71-Infektion im Magen-Darm-Epithel beteiligt10,11. Unsere Beobachtungen legen nahe, dass in diesem Modell absorbierende Kolonozyten und nicht Becherzellen der hauptsächlich infizierte Zelltyp waren. Dieser Befund schließt eine Infektion von Becherzellen in Epithelien nicht aus, in denen Becherzellen häufiger vorkommen.

Wir beobachteten infizierte Zellen in mehreren unterschiedlichen Zuständen, die an die Stadien der kanonischen Extrusion ganzer Zellen erinnern (Abb. 2l, m). Die Zellextrusion ist ein hochkoordinierter Prozess, der die Entfernung unerwünschter Zellen ermöglicht und gleichzeitig die Integrität der Epithelbarriere aufrechterhält18,19. Während der kanonischen Extrusion ordnen Zellen, die zur Extrusion bestimmt sind, und ihre Nachbarzellen ihr Zytoskelett neu an, um die Basis der extrudierten Zellen zu umgeben; Diese Aktin-Myosin-Ringe ziehen sich apikal zusammen, um die extrudierten Zellen durch einen sogenannten „Geldbörsenmechanismus“ herauszudrücken (Abb. 2n)20. Gleichzeitig bilden sich zwischen den neuen Nachbarzellen unterhalb der extrudierten Zellen wieder enge Verbindungen, um die Integrität des Epithels aufrechtzuerhalten21,22. Die Zellverdrängung und die Bildung neuer Nachbarn erfolgen über einen Zeitraum von etwa 40 Minuten. Extrudierte Zellen haften weitere 40 Minuten am Epithel, bevor sie sich von ihren Nachbarn lösen und davonschweben20,23. Wir beobachteten infizierte Zellen in Zuständen, die sowohl dem frühen als auch dem späten Stadium der Extrusion entsprachen, wie in Abb. 2l dargestellt. Auf der linken Seite ist eine infizierte Zelle zu sehen, eingebettet in ein Organoid, umgeben von einer Aktinschicht, die sich unter der infizierten Zelle verdichtet. Das mittlere Bild zeigt eine extrudierte Zelle, die immer noch Kontakt mit einer neu gebildeten, intakten apikalen Oberfläche hat. Die vollständig abgelöste infizierte Zelle auf der rechten Seite wurde beobachtet, wie sie neben infizierten Organoiden in Suspension schwebte.

Um zu untersuchen, ob das Phänomen der Extrusion infizierter Zellen spezifisch für EV-A71 war, untersuchten wir Zellen, die mit Poliovirus, einem Mitglied der verwandten Enterovirus-C-Spezies, infiziert waren. In Organoiden, die aus Ileumgewebe des Dünndarms sowie aus Dickdarmgewebe stammen, konnten leicht extrudierte Poliovirus-infizierte Zellen beobachtet werden (Abb. 2n, o und Extended Data Abb. 1). Wir schlagen vor, dass mehrere Enteroviren den Auswurf infizierter Zellen aus gastrointestinalen Organoiden durch Ganzzellextrusion auslösen. Wir stellten außerdem die Frage, ob die Extrusion von EV-A71-infizierten Zellen spezifisch für die Epithelarchitektur von apikal nach außen gerichteten Organoiden sei. In den kontrastierenden basolateralen Kolonoiden konnte jedoch leicht eine Extrusion infizierter Zellen beobachtet werden (Erweiterte Daten, Abb. 2).

Um den Zeitpunkt der Extrusion infizierter Zellen zu charakterisieren, haben wir infizierte Zellen in Kolonoiden während der ersten Infektionsrunde sichtbar gemacht (Erweiterte Daten, Abb. 3 und Ergänzungstabelle 2). Wir beobachteten, dass infizierte Zellen bereits 5 Stunden und erst 9 Stunden nach der Infektion extrudiert werden können und dass die extrudierten infizierten Zellen zu jedem Zeitpunkt reichlich vRNA enthielten. Daher tragen wahrscheinlich Unterschiede in der Infektionskinetik von Zelle zu Zelle24 zum Zeitpunkt der Extrusion bei. Die Anzahl infizierter Zellen in Kolonoiden stieg 5 bis 7 Stunden nach der Infektion signifikant an, ging danach jedoch deutlich zurück, obwohl die Menge an infektiösem Virus in der gesamten Kultur weiter anstieg (Abb. 1b). Dass infizierte Zellen überwiegend zwischen 7 und 9 Stunden nach der Infektion ausgeschieden werden, steht im Einklang mit dem Fehlen einer beobachteten Übertragung von Zelle zu Zelle innerhalb der Kolonoiden.

Die Extrusion apoptotischer Zellen aus intakten Epithelien wurde ursprünglich als Mittel zur Entfernung absterbender Zellen beschrieben, ohne die Epithelbarriere zu beeinträchtigen20. Angesichts der Tatsache, dass eine EV-A71-Infektion in mehreren Zelltypen Apoptose auslösen kann25,26,27,28, haben wir getestet, ob die apoptotische Signalübertragung die Extrusion infizierter Zellen in Kolonoiden auslöst. Wir verwendeten ein fluorogenes Substrat (CellEvent, ThermoFisher), um Zellen sichtbar zu machen, die die aktiven Caspasen 3 und 7 exprimierten. Infizierte Organoide wurden mit Substrat inkubiert, fixiert, auf doppelsträngige RNA gefärbt und durch konfokale Mikroskopie untersucht (Abb. 3a – e). Ungefähr die Hälfte der nicht infizierten extrudierten Zellen war Caspase 3/7 positiv, was mit der normalen Funktion der Zellextrusion in Darmepithelien übereinstimmt29. Allerdings war ein deutlich geringerer Anteil infizierter, extrudierender Zellen Caspase 3/7-positiv (Abb. 3f und Ergänzungstabelle 3). Darüber hinaus waren die Kerne in infizierten extrudierenden Zellen normalerweise intakt und wiesen nicht die für apoptotische Zellen charakteristischen verdichteten und fragmentierten Kerne auf. Diese Daten belegen, dass apoptotischer Stress nicht zur Extrusion infizierter Zellen führt.

Infizierte Kolonoide wurden 48 Stunden nach der Infektion durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die Aktivität von Caspase 3 und 7 wurde mithilfe eines fluorogenen Substrats sichtbar gemacht. a, Einzelne infizierte Organoide mit extrudierten Zellen. b, Erhöhte Vergrößerung einer einzelnen nicht infizierten, apoptotisch extrudierenden Zelle in a. c, Erhöhte Vergrößerung von zwei infizierten, nicht-apoptotisch extrudierenden Zellen in a. d, Einzelne infizierte Organoide mit extrudierten Zellen. e, Vergrößerung zweier extrudierender Zellen in d. f: Anteile infizierter extrudierender und nicht infizierter extrudierender Zellen, die apoptotisch waren, wurden quantifiziert, wobei die Gesamtwerte für jedes Experiment als Dreiecke dargestellt wurden. Jede Farbe stellt ein unabhängiges Experiment dar, wobei die Messungen für jedes einzelne Organoid als kleine Kreise angezeigt werden. *P < 0,05; gepaarter, zweiseitiger t-Test, N = 3; Horizontale Balken und Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar. Die in diesem Diagramm dargestellten rohen Zellzahlen werden in der Ergänzungstabelle 3 angezeigt. Maßstabsbalken, 10 µm.

Quelldaten

Zusätzlich zum apoptotischen oder pyroptotischen Zelltod kann die Extrusion von Zellen aus dem Magen-Darm-Epithel durch mechanische Kräfte auf Zellen aufgrund einer Überfüllung ausgelöst werden30,31. Obwohl er bei der Extrusion apoptotischer Zellen keine Rolle spielt, erkennt der mechanosensitive Ionenkanal Piezo1 den Zellstauungsstress und reagiert darauf, wodurch die Zellextrusion ausgelöst wird29. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine Veränderung der biomechanischen Eigenschaften infizierter Zellen durch Piezo1 erfasst werden könnte, was zu einer kraftabhängigen Extrusion infizierter Zellen führt. Um diese Hypothese zu testen, behandelten wir infizierte Kolonoiden mit GsMTx4, einem Spinnengiftpeptid, das die Aktivität mechanosensitiver Ionenkanäle einschließlich Piezo1 hemmt (Lit. 32,33). Wir untersuchten auch die Wirkung von Z-VAD-FMK, einem Pan-Caspase-Inhibitor, der bekanntermaßen die Extrusion apoptotischer Zellen reduziert23. Da die Aktin-Myosin-Neuanordnung für die Zellextrusion unabhängig vom anfänglichen Auslöser von entscheidender Bedeutung ist, testeten wir schließlich die Wirkung des Myosin-II-Inhibitors Para-Nitro-Blebbistatin34 als Positivkontrolle für die Hemmung aller Zellextrusionsmechanismen35,36 (Abb. 4e). ).

Mit EV-A71 infizierte Organoide wurden Verbindungen ausgesetzt, die zelluläre Faktoren hemmen können, die an verschiedenen Extrusionsmechanismen beteiligt sind. a–d: Infizierte Organoide wurden 0,5 % DMSO-Vehikelkontrolle (a), 50 μM para-Nitroblebbistatin (b), 100 μM Z-VAD-FMK (c) oder 20 μM GsMTx4 (d) ausgesetzt. Infizierte Zellen in Organoiden wurden visuell durch konfokale Mikroskopie untersucht. Gelbe Pfeilspitzen weisen auf infizierte Zellen in repräsentativen Organoiden hin. Maßstabsbalken, 10 μm. e, Blebbistatin hemmt sowohl die apoptotische als auch die mechanosensitive Extrusion, Z-VAD-FMK hemmt nur die apoptotische Extrusion und GsMTx4 hemmt nur die mechanosensitive Extrusion. f: Der Prozentsatz der infizierten Zellen, die nach 7 Stunden Infektion einer Extrusion unterzogen wurden, wurde gezählt. Jede Farbe zeigt ein unabhängiges Experiment. Der Gesamtanteil der pro Experiment extrudierten infizierten Zellen wird als Dreiecke dargestellt, wobei die Messungen für jedes Organoid als kleine Kreise dargestellt werden. **P < 0,01; NS, nicht signifikant; Wiederholte Messungen, einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett, N = 3, g. Virustiter, 7 Stunden nach der Infektion aus infizierten Suspensionsorganoidkulturen quantifiziert, zeigen keine signifikanten Auswirkungen medikamentöser Behandlungen auf die Virusausbeute. Wiederholte Messung der einfaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett, N = 3 unabhängige Infektionen. In f und g stellen horizontale Balken und Fehlerbalken den Mittelwert ± Standardabweichung dar

Quelldaten

Nach einer zweistündigen Infektion mit EV-A71 wurden die Kolonoiden für den Rest eines einzelnen Infektionszyklus mit den oben genannten Verbindungen behandelt (Abb. 4a – d). Der Anteil der aus Kolonoiden extrudierten infizierten Zellen wurde unter jeder Bedingung quantifiziert (Abb. 4f). Wie erwartet wurde der Prozentsatz infizierter Zellen, die aus Organoiden extrudierten, in Gegenwart von Blebbistatin verringert und blieb von Z-VAD-FMK, das nur die apoptotische Extrusion hemmt, unbeeinflusst. Wir beobachteten jedoch eine bemerkenswerte Verringerung des Prozentsatzes infizierter Zellen, die in Gegenwart des mechanosensitiven Ionenkanalinhibitors GsMTx4 einer Extrusion unterzogen wurden (Abb. 4f). Um die Möglichkeit auszuschließen, dass dies auf eine Hemmung des Viruswachstums zurückzuführen ist, haben wir die Wirkung aller Verbindungen auf die Virusausbeute bewertet, wobei keine davon verändert wurde (Abb. 4g). Diese Ergebnisse legen nahe, dass es die kraftempfindliche Aktivität mechanosensitiver Ionenkanäle ist, auf die GsMTx4 abzielt, die für die Eliminierung lebender, EV-A71-infizierter Zellen entscheidend ist.

Um festzustellen, ob die extrudierten, infizierten Zellen eine Quelle für die Virusausbreitung im Magen-Darm-Trakt darstellen könnten, wurden extrudierte Zellen (Zellen) durch differenzielle Sedimentation (Methoden) gesammelt und die darin enthaltene Virusmenge bestimmt. Um zu bestätigen, dass durch Waschschritte zellfreie Viren effizient aus der Zellfraktion entfernt wurden, wurden 106 Plaque-bildende Einheiten exogener Viren in einen Satz (Zellen + Medien)-Proben gegeben. Das zugegebene Virus erhöhte den Virustiter in Cells + Media-Proben erheblich (Abb. 5b). Allerdings blieb der Virustiter in den Zellen durch den Spike-In von exogenem Virus unverändert, was zeigt, dass die Waschungen potenziell kontaminierende freie Viren erfolgreich eliminierten. Darüber hinaus gab es, wie in Abb. 5c gezeigt, in den extrudierten Zellfraktionen deutlich mehr infektiöse Viren als in zellfreien Medien.

a: EV-A71-infizierte Kolonoidkulturen wurden 8 Stunden nach der Infektion gesammelt und die Komponenten wurden durch Differenzialsedimentation gesammelt. b: Um die Wirksamkeit des Waschens extrudierter Zellen zu beurteilen, wurden 106 PFU exogenes freies Virus in Zellen + Medienproben gegeben. Fraktionen einschließlich Whole Well (leere Balken), Zellen + Medien (kleine gepunktete Balken) und Zellen (große gepunktete Balken) wurden einem Gefrier-Auftau- und Plaque-Assay unterzogen. Einfaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen und dem Holm-Šídák-Mehrfachvergleichstest. NS, nicht signifikant. c, Verteilung des Virus in Zellen und in Medien. Verhältnisgepaarter, zweiseitiger T-Test. d, Stabilität des Virus aus Zell- und Medienfraktionen. Die gesammelten Fraktionen wurden für die angegebene Zeit bei 37 °C inkubiert, wiederholtem Einfrieren und Auftauen und anschließendem Plaque-Assay unterzogen. Die Virusmengen werden vor der Inkubation auf Werte von c normalisiert. Zweifaktorielle ANOVA mit Geisser-Gewächshaus-Korrektur. e, intakte extrudierte Zellfraktionen und freies Virus aus der letzten Zellwäsche wurden zur Infektion von RD-Zellmonoschichten verwendet. Die Virustiter in den infizierten RD-Zellen wurden 1 Stunde und 16 Stunden nach Beginn der Sekundärinfektion gemessen. Verhältnis von gepaarten (Zellen–Zellen; Wasch–Wasch) und ungepaarten (Wasch–Zellen), zweiseitigen t-Tests. Die gestrichelte Linie zeigt die Nachweisgrenze an. f, Zellfraktionen und freies Virus aus der letzten Zellwäsche wurden zur Infektion neuer Kolonoiden verwendet. Nach 2 und 16 Stunden wurde die Virusmenge in den Whole-Well-Fraktionen durch Plaque-Assay bestimmt. Statistische Prüfung wie in z. B. beschrieben. g,h, Konfokalmikroskopie von sekundär infizierten RD-Zellen (g) und mit Zellen inokulierten Organoiden nach 16 Stunden (h). Maßstabsbalken, 10 μm. h, Sekundär infiziertes Organoid mit mehreren infizierten Zellen. Unten: orthogonaler Querschnitt durch die sekundär infizierte, extrudierende Zelle, angezeigt durch die gelbe Pfeilspitze. i, EV-A71-infizierte Kolonoidkulturen wurden mit GsMTx4 oder Vehikel behandelt und die Fraktionen wurden nach 8 Stunden gesammelt. Während die GsMTx4-Behandlung die Menge an infektiösem Virus in extrudierten Zellen reduzierte, erhöhte sich die Menge an infektiösem freien Virus in den Medien. Mehrere gepaarte, zweiseitige t-Tests mit der Holm-Šídák-Korrektur für mehrere Vergleiche. In b–f und i ist ein repräsentatives Experiment mit unabhängigen Infektionen gezeigt, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; Die dargestellten Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung

Quelldaten

Um festzustellen, wie lange die extrudierten Zellen nach der Extrusion am Leben blieben, überwachten wir den apoptotischen Zustand der Zellen nach 48 Stunden. Zu diesem Zeitpunkt war die Mehrheit der infizierten und nicht infizierten extrudierten Zellen Caspase 3/7-positiv (Extended Data Abb. 4), was darauf hindeutet, dass die infolge einer Virusinfektion extrudierten Zellen schließlich einen durch Ablösung induzierten apoptotischen Zelltod erleiden. Um zu testen, ob der Aufenthalt in diesen sterbenden, extrudierten Zellen die residenten Virionen schädigte, wurden die in Abb. 5c gezeigten Zell- und Medienpräparate bei 37 °C inkubiert. Alle Proben wurden vor dem Plaque-Assay wiederholtem Einfrieren und Auftauen unterzogen, um die Zellen zu lysieren. Über einen Zeitraum von 48 Stunden behielten die in den Zellen befindlichen Viren ihre Stabilität ebenso wie die freien Viren in den Medien (Abb. 5d). Daher enthalten infizierte Zellen, die aus dem Dickdarmepithel ausgestoßen werden, stabile, infektiöse Viren.

Um herauszufinden, ob extrudierte Zellen selbst infektiös sind, wurden Zellfraktionen aus infizierten Kolonoiden hergestellt und als Inokula für Sekundärinfektionen verwendet (Abb. 5e, f). Das Viruswachstum sowohl in sekundär infizierten Rhabdomyosarkom (RD)-Zellmonoschichten als auch in zuvor nicht infizierten Kolonoiden wurde durch Vergleich der Titer unmittelbar nach der Infektion und nach 16 Stunden Infektion untersucht. Als Kontrolle für eine wirksame Isolierung der Zellen von allen verbleibenden freien Viren wurden auch Überstände der letzten von drei Wäschen als Inokula verwendet. In Kulturen, die mit Zellen infiziert waren, die aus zuvor infizierten Organoiden extrudiert wurden, war unmittelbar nach der Infektion reichlich Virus vorhanden (Abb. 5e, f), und bei der Inkubation wurde ein signifikanter Anstieg beobachtet. Wichtig ist, dass die Virusmenge in Kulturen, die mit extrudierten Zellen infiziert waren, nach 16 Stunden deutlich höher war als in Kulturen, die mit Waschüberstand infiziert waren, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein extrudierter Zellen und nicht restliches zellfreies Virus für die hohe Viruslast verantwortlich war . Konfokale Mikroskopie bestätigte das Vorhandensein infizierter Zellen in sekundär infizierten RD-Monoschichten und Kolonoiden (Abb. 5g, h). Daher sind extrudierte, virushaltige Zellen sowohl für RD-Monoschichten als auch für apikal nach außen gerichtete, differenzierte Kolonoide infektiös.

Um das Schicksal der Viren und Zellen zu bestimmen, die in der Epithelschicht des Kolonoids zurückgehalten wurden, als die Extrusion gehemmt wurde, wurden Kolonoide mit EV-A71 infiziert und ganze Well-, Organoid-, Zell- und Medienfraktionen (Abb. 5a) wurden durch differenzielle Sedimentation gesammelt (Methoden, Erweiterte Daten Abb. 5 und Ergänzungstabelle 4). Die Proben wurden vor dem Plaque-Assay wiederholtem Einfrieren und Auftauen unterzogen, um intrazelluläre Viren freizusetzen. Wie erwartet hatte die Hemmung der Kraftwahrnehmung durch die Behandlung mit GsMTx4 keinen Einfluss auf das gesamte Viruswachstum, wie aus der Whole Well-Fraktion hervorgeht, obwohl in der extrudierten Zellfraktion deutlich weniger Viren gefunden wurden. Die Menge an infektiösem Virus in intakten Organoiden wurde durch die GsMTx4-Behandlung nicht erhöht, obwohl die Freisetzung infizierter Zellen blockiert wurde. Stattdessen wurde bei blockierter Extrusion deutlich mehr Virus in der Medienfraktion beobachtet (Abb. 5i). Wir vermuten, dass die Extrusion von Zellen aus der Epithelschicht das Ergebnis verhindert, das sonst eintreten würde: die Freisetzung zellfreier Viren.

Infizierte Zellen sind verschiedenen metabolischen, oxidativen und fehlfaltenden Belastungen ausgesetzt, die angeborene zelluläre Reaktionen wie Apoptose, Autophagie und die Synthese von Entzündungsmediatoren auslösen. Erfolgreiche Viren hemmen oder untergraben viele dieser Reaktionen, um die Virusreplikation zu fördern. Hier berichten wir, dass EV-A71 auch mechanosensorische Signalwege beeinflusst. In den polarisierten Zellen von Dickdarmorganoiden werden EV-A71-infizierte Zellen bevorzugt in das apikale extrazelluläre Milieu extrudiert, das dem Dickdarmlumen entspricht. Dieser Prozess könnte sowohl für den Wirt von Vorteil sein, da infizierte Zellen aus dem Darmepithel entfernt werden, als auch für die Viruspopulation, deren kollektive Extrusion wahrscheinlich die Übertragung zwischen Wirten erleichtert. Bei EV-A71-infizierten Mäusen wurde bereits zuvor eine Verkürzung der Darmzotten beobachtet37,38. Eine Verkürzung der Zotten in anderen Krankheitskontexten resultiert aus einem erhöhten Zellverlust durch Extrusion39. Daher steht die mechanosensitive Ausstoßung infizierter Zellen aus Organoiden im Einklang mit diesen In-vivo-Beobachtungen und könnte diese erklären.

In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass die Extrusion von EV-A71-infizierten Enterozyten aus polarisierten menschlichen Kolonoiden durch das kleine Peptid GsMTx4, einen Inhibitor mechanosensitiver Ionenkanäle, behindert wird33. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Krafterkennung der Auslöser für die Extrusion infizierter Zellen ist. In kultivierten polarisierten Monoschichten und Darmepithelien fungiert der kraftempfindliche Ionenkanal Piezo1 bekanntermaßen als Sensor für die Homöostase der Zelldichte29,40. Wenn Epithelien überfüllt sind, induziert Piezo1 die Extrusion lebender, nicht-apoptotischer Zellen, bis die homöostatische Zellzahl wiederhergestellt ist29. Piezoproteine sind in Plasmamembranen eingebettete Homotrimere mit propellerähnlichen Armen und einer zentralen Ca+2-durchlässigen Pore41. Bei der Verformung der Plasmamembran durch mechanische Kraft wird angenommen, dass sich die Arme neu positionieren und eine Konformationsänderung induzieren, bei der sich die Pore öffnet41. Wir gehen davon aus, dass Piezo1 ein wahrscheinlicher Kandidat für die hier beschriebene gewaltsame Extrusion infizierter Zellen ist.

In dieser Studie beobachteten wir, dass die infizierten Zellen, die aus menschlichen Kolonoiden extrudierten, abgerundet waren und die Aktin-Mikrovilli auf ihren apikalen Oberflächen verloren hatten. Im Gegensatz dazu schienen infizierte Zellen innerhalb von Kolonoiden in Größe und Form denen nicht infizierter Nachbarn zu ähneln. Es ist bekannt, dass Enteroviren eine globale Neuorganisation von Wirtszellkomponenten, einschließlich aller Zytoskelettelemente, bewirken42,43,44. Tatsächlich tragen drastische Veränderungen des Zytoskeletts maßgeblich zur häufig verwendeten Beschreibung der „zytopathischen Wirkung“ bei, die durch viele Viren verursacht wird45. Eine Verringerung sowohl der Membranspannung als auch der Zytoskelettbindung wurde mit der Piezo1-Aktivierung in Verbindung gebracht41,46,47. Es ist wahrscheinlich, dass durch eine Virusinfektion verursachte Störungen des Zytoskeletts die biomechanischen Eigenschaften von EV-A71-infizierten Zellen verändern, was zur Piezo1-Aktivierung und anschließenden Extrusion führt (Extended Data Abb. 6).

Die Entfernung infizierter Zellen durch mechanische Zellkonkurrenz könnte dem Wirt zugute kommen, indem die lokale Virusausbreitung im infizierten Gewebe begrenzt wird. Darüber hinaus wurde bei Blockierung der Extrusion ein Anstieg des extrazellulären Virus beobachtet, was darauf hindeutet, dass infizierte Zellen, die gezwungen sind, in Organoiden zu bleiben, Viren durch Lyse oder unkonventionelle Sekretion in das Medium freisetzen. Wenn infizierte Zellen kurz vor der Lyse stehen, könnte ihre Extrusion dem Wirt zugute kommen, indem sie die Epithelbarriere aufrechterhält, Entzündungen reduziert oder beides (Abb. 6).

Mit EV-A71 infizierte Zellen, die aus dem Dickdarm in das Magen-Darm-Lumen extrudiert werden, könnten eine wesentliche Rolle bei der fäkal-oralen Übertragung spielen. Wenn Zellen, die infektiöse Viren tragen, extrudiert werden, ist zu erwarten, dass Nachkommen-Virionen durch den Darm wandern und in lebenden extrudierten Zellen mit dem Stuhl ausgeschieden werden. Innerhalb von Zellen können Virionen vor Darminhalten wie Schleimhautantikörpern geschützt sein. Die Bündelung von Virionen innerhalb der Zelle könnte zusätzlich die En-bloc-Übertragung erleichtern und so die Aufrechterhaltung der viralen Genomvielfalt ermöglichen. Die potenziellen Vorteile der Extrusion infizierter Zellen in vivo für den Wirt, wie z. B. eine schnellere Virusclearance oder eine verbesserte Toleranz gegenüber Infektionen, bleiben interessante offene Fragen für weitere Untersuchungen.

Extrudierte Zellen könnten auch als Mittel zur Virusausbreitung von einer Region des Magen-Darm-Gewebes in eine weiter entfernte Region desselben Wirts oder eines anderen Wirts dienen (Abb. 6). Wir fanden heraus, dass mit EV-A71 infizierte Zellen selbst sowohl für Zellmonoschichten als auch für zuvor nicht infizierte Organoide infektiös sind. Der Durchgang durch den Dickdarm innerhalb einer extrudierten Zelle könnte Virionen vor Lumeninhalten wie Schleimhautantikörpern schützen (Abb. 6). Eine solche En-bloc-Virusabgabe kann aufgrund der Übertragung konzentrierter Viren und der Aufrechterhaltung der Komplexität der intrazellulären viralen Quasispeziespopulation mehrere Konsequenzen haben5,48,49,50.

Unsere Ergebnisse ergänzen die wachsende Zahl an Beweisen dafür, dass intrazelluläre Krankheitserreger durch den kontrollierten Auswurf infizierter Zellen über verschiedene Mechanismen aus Epithelschichten entfernt werden können. Rotavirus, Reovirus, Respiratory-Syncytial-Virus und Salmonellen lösen alle einen pyroptotischen oder apoptotischen Zelltod in einzelnen infizierten Zellen aus, die anschließend extrudiert werden31,51,52,53,54. Im Gegensatz dazu induzieren sowohl Listerien als auch Masernviren eine massenhafte Ausscheidung, wobei zahlreiche lebende infizierte Zellen große Hügel bilden, die sich auf polarisierten Epithelien ansammeln36,55,56. Das hier beschriebene einzigartige Phänomen der kraftabhängigen Einzelzellextrusion infizierter Zellen kann mit einer Infektion mit weiteren intrazellulären Krankheitserregern einhergehen, die noch identifiziert werden müssen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Ergebnisse das Phänomen der Lebendextrusion virusinfizierter Zellen identifizieren, die durch mechanosensitive Ionenkanalaktivität ausgelöst wird. Die mechanosensitive Extrusion kann einer entscheidenden Funktion des angeborenen Immunsystems dienen, indem sie die Ausstoßung infizierter Zellen aus dem Epithelgewebe initiiert. Da extrudierte Zellen eine weitere Virusinfektion auslösen können, kann die Ausscheidung virusinfizierter Zellen darüber hinaus als bislang unbeachtetes Mittel zur fäkal-oralen Übertragung dienen.

Organoide wurden nach den in Lit. beschriebenen Prinzipien erzeugt. 8. Gastrointestinale epitheliale Organoide wurden zuvor vom Labor von Calvin Kuo an der Stanford University13 durch Präparation gesunder menschlicher Magen-Darm-Gewebebiopsien erzeugt. Diese wurden anonymisiert und von der Stanford Tissue Bank mit Zustimmung des Patienten und Genehmigung des Institutional Review Board der Stanford University beschafft. Gewebebiopsien wurden ohne spezifische Erhebung von Patienteninformationen zu Alter und Geschlecht durchgeführt und es wurde keine gezielte oder geplante Registrierung durchgeführt (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124719301457?via%3Dihub).

Zur Erhaltung wurden Organoide in der Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Typ II (BME, äquivalent zu Matrigel) in Tröpfchen in einer mit Gewebekultur behandelten Platte mit 24 Vertiefungen (40 µl pro Vertiefung) ausgesät. BME wurde durch 10-minütige Inkubation bei 37 °C polymerisiert, dann wurde BME mit Wachstumsmedium überschichtet. Das Wachstumsmedium besteht aus Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12, 1 mM HEPES, 1× Glutamax, 1× B27 (ohne Vitamin A), 1 mM N-Acetylcystein (nur für Darm- und Dickdarmproben), 10 nM Gastrin, 50 ng ml-1 epidermaler Wachstumsfaktor, 10 mM Nicotinamid, 500 nM A83-01, 10 µM SB202190, 100 ng ml-1 FGF10 (nur für Magenproben) und 50 % L-WRN-konditioniertes Medium (enthält Wnt3a, R-Spondin 3 und Noggin). L-WRN-konditioniertes Medium wurde aus L-WRN-Zellen hergestellt57. Das mit L-WRN konditionierte Medium wurde aliquotiert und zur Langzeitlagerung bei –80 °C eingefroren, ohne dass negative Auswirkungen auf das Organoidwachstum beobachtet wurden. Das Wachstumsmedium wurde nach Bedarf alle 1–4 Tage ausgetauscht.

Zur Passage wurden die Organoide in TrypLE Express 10–15 Minuten lang bei 37 °C in einzelne Zellen dissoziiert, manuell durch Pipettieren aufgebrochen und anschließend Trypsin mit FBS inaktiviert. Auf Eis wurden die Zellen durch ein 70-µm-Poren-Nylonnetz-Zellsieb filtriert, um große Zellklumpen oder undissoziierte Organoide zu entfernen. Die Zellen wurden auf einem Countess II-Zellzähler (ThermoFisher) gezählt und in BME mit einer Konzentration von 5 × 103 bis 1,5 × 104 Zellen pro Vertiefung erneut ausgesät. Für 2–3 Tage nach der ersten Passage wurden 10 µM Y27623 und 250 nM CHIR99021 in das Wachstumsmedium gegeben, um den durch Ablösung verursachten Zelltod zu verhindern. Organoide wurden nach Bedarf alle 4–10 Tage passagiert. Alle verwendeten Organoide wurden mit Myco-Sniff (MP Biomedicals) getestet, um sicherzustellen, dass keine Mykoplasmenkontamination vorlag.

Nach 4–7 Tagen Wachstum wurden die Organoide aus Matrigel entfernt und dazu veranlasst, ihre Polarität umzukehren, um die apikale Oberfläche freizulegen12. Organoide wurden in 5 mM EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4 °C 40 Minuten lang inkubiert, mit DMEM gewaschen und in Differenzierungsmedium resuspendiert: Advanced DMEM/F12, 1 mM HEPES, 1× Glutamax, 1× B27, 1 mM N-Acetylcystein (nur für Darm- und Dickdarmproben), 10 nM Gastrin, 50 ng ml−1 epidermaler Wachstumsfaktor, 10 ng ml−1 Noggin, 500 nM A83-01, 5 µM γ-Sekretase-Inhibitor IX ( auch bekannt als DAPT, nur für Dickdarmproben), 100 ng ml−1 FGF10 (nur für Magenproben) und 10 µM Y27623. Organoide in Suspensionskultur wurden in Ultra-Low-Attachment-Platten oder -Flaschen (Corning Costar) ausplattiert und 5 Tage lang bei 37 °C inkubiert, um die Differenzierung und Polaritätsumkehr vor der experimentellen Verwendung abzuschließen.

RD-Zellen, ein Geschenk aus dem Labor von Peter Sarnow, wurden in DMEM (Hyclone; 4.500 mg l-1 Glucose, 4 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Omega Life Sciences). 1× nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA, Gibco) und 1× Penicillin-Streptomycin (Gibco). RD-Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet. HeLa-Zellen wurden in DMEM (Hyclone; 4.500 mg l-1 Glucose, 4 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Omega Life Sciences) und 1 × Penicillin-Streptomycin (Gibco). Weder RD- noch HeLa-Zellen stehen auf der Liste bekannter falsch identifizierter Zelllinien, die vom International Cell Line Authentication Committee (https://iclac.org/databases/cross-contaminations/) geführt wird. Informationen zur Authentifizierung von Zelllinien finden Sie in den Zusatzinformationen.

Der EV-A71-Stamm Taiwan/4643/98 wurde aus einem infektiösen Klon amplifiziert, der vom Labor von Jen-Ren Wang unter Verwendung von RD-Zellen hergestellt wurde58. Die vollständige komplementäre DNA-Sequenz des verwendeten Virusstamms finden Sie unter der GenBank-Zugangsnummer JN544418. Es wurden Virusbestände aus der zweiten Viruspassage in RD-Zellen erzeugt und für Infektionen genutzt. Der Virustiter wurde durch einen Plaque-Assay an RD-Zellen unter Verwendung einer 0,3 % (Gew./Vol.) Agarose-Überschichtung bestimmt; Die Plaques wurden nach 3 Tagen mit 2 % Formaldehyd fixiert und durch Anfärben mit Kristallviolett gezählt. Poliovirus Typ 1 Mahoney wurde aus einem infektiösen Klon amplifiziert und in HeLa-Zellen amplifiziert. Der Virustiter wurde durch einen Plaque-Assay auf HeLa-Zellen unter Verwendung einer 1,2 % (Gew./Vol.) Avicel-Überschichtung bestimmt; Die Plaques wurden auf ähnliche Weise fixiert und nach 2 Tagen zur Zählung gefärbt.

Differenzierte, apikal nach außen gerichtete Organoide (5 Tage nach der Differenzierung und Polaritätsumkehr) wurden mit dem EV-A71-Stamm 4643 infiziert. Da RD-Zellen sehr anfällig für eine EV-A71-Infektion sind, entspricht die durch RD-Zellen definierte Infektionsmultiplizität einer viel selteneren Infektion in Organoiden. Organoide wurden daher einer hohen Infektionsmultiplizität (MOI, 620 PFU pro Zelle) ausgesetzt, um eine Infektion zu etablieren, bei der fünf oder weniger Zellen pro Organoid infiziert wurden. Apikale Organoide wurden aus Dickdarm-, Magen- und Zwölffingerdarmgewebe hergestellt und mit EV-A71 infiziert. Von diesen drei Geweben waren Kolonoide am stärksten infiziert (Abb. 1b und erweiterte Daten, Abb. 7).

Um suspendierte Organoide vor der Infektion von Trümmern zu trennen, wurden Organoide in einem konischen 15-ml-Röhrchen gesammelt und durch Schwerkraft auf der Tischplatte (1 g) 5–10 Minuten lang pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und die pelletierten Organoide wurden einmal in DMEM gewaschen. Die Schwerkraftpelletierung führte zu einer sehr geringen Kontamination mit einzelnen Zellen (Extended Data Abb. 5 und Ergänzungstabelle 4). Ein Aliquot dieser Organoidsuspension wurde entnommen, mit TrypLE Express dissoziiert und auf dem Countess II Cell Counter (ThermoFisher) gezählt, um die Zellen in der Organoidsuspension für MOI-Berechnungen zu zählen. Für Experimente, bei denen dreifache Infektionen durchgeführt wurden, wurde die Organoidsuspension in drei konische Röhrchen aufgeteilt. Organoide wurden 3 Minuten lang bei 300 g pelletiert und in einem geeigneten Volumen Virusstamm (3,7 × 108 PFU ml-1) resuspendiert, auf eine Ultra-Low-Attachment-Platte übertragen und 2 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Organoide dreimal in DMEM gewaschen und drei Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Nach dem dritten Waschgang wurden die Organoide in warmem Differenzierungsmedium resuspendiert und in Gewebekulturplatten mit extrem geringer Anhaftung ausplattiert. Gegebenenfalls wurden dann pharmakologische Behandlungen hinzugefügt. Infizierte Organoide wurden bis zum experimentellen Endpunkt bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. In Experimenten, bei denen der Gesamtvirustiter quantifiziert wurde, wurde die gesamte Organoidsuspension gesammelt und die Probe drei wiederholten Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen, um die Zellen vor dem Plaque-Assay zu lysieren.

Für Experimente, bei denen differenzierte, basolaterale Kolonoide mit EV-A71 infiziert wurden, wurden die Kolonoide 5 Tage lang in Wachstumsmedium gezüchtet und vor der Infektion 5 Tage lang differenziert, ohne vom BME-Gelgerüst entfernt zu werden. Am Tag der Infektion wurden Kolonoide durch 40-minütige Inkubation in 5 mM EDTA aus der polymerisierten BME-Matrix entfernt. Nach einmaligem Waschen mit DMEM wurden die Kolonoide in kaltem Differenzierungsmedium mit EV-A71-Inokulum (MOI 1.300 PFU pro Zelle) resuspendiert, ergänzt mit 20 % (v/v) BME, um eine Polaritätsumkehr in der Suspensionskultur zu verhindern. Kolonoide in Gegenwart von EV-A71 wurden in Gewebekulturplatten mit extrem geringer Anhaftung ausplattiert und vor der Fixierung 8 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.

Bei Poliovirus-Infektionen wurden differenzierte, apikal nach außen gerichtete Ileum- und Dickdarmorganoide mit der oben für EV-A71-Infektionen beschriebenen Methode infiziert. Ileum-Organoide wurden mit einer MOI von 10 PFU pro Zelle infiziert und bei 22 hpi fixiert. Dickdarmorganoide wurden mit einer MOI von 1 PFU pro Zelle infiziert und bei 42 hpi fixiert.

Organoide wurden in 2 % Paraformaldehyd in 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) mindestens 30 Minuten lang fixiert und mit PBS gewaschen. Organoide wurden durch Inkubation mit Antikörpern und/oder Farbstoffen in Blockierungs-/Permeabilisierungspuffer (PBS mit 3 % Rinderserumalbumin, 1 % Saponin und 0,02 % Natriumazid) über Nacht unter leichtem Rühren gefärbt. Gefärbte Organoide wurden dreimal in PBS gewaschen und mit Vectashield-Eindeckmedium (Vector Laboratories, H-1000) auf Glasobjektträger montiert, und Glasdeckgläser wurden mit Vakuumfett befestigt. Organoide wurden auf einem konfokalen LSM 700-Mikroskop (Carl Zeiss) mit der Zen 2009-Software (Carl Zeiss) bei 40-facher oder 63-facher Vergrößerung mit Ölimmersionsobjektiven abgebildet. 3D-Renderings von Organoiden wurden mit der Volocity 3D Image Analysis Software (PerkinElmer Version 5.3) erstellt.

Organoide wurden mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI; Life Technologies, D1306) und Alexa Fluor 660 Phalloidin (Invitrogen, Kat.-Nr. A22285) gefärbt, um Kerne und Aktin sichtbar zu machen. Primärantikörperverdünnungen wurden in den folgenden Verdünnungen durchgeführt: Maus-Anti-dsRNA-IgG2a-Kappa-Ketten-Antikörper (J2) SCICONS (erworben von Nordic MUbio) Kat.-Nr. NEIN. 10010200, RRID: AB_2651015 (1:500), rekombinanter monoklonaler Kaninchen-anti-LIMP2/SCARB2-Antikörper (22H6L14) ThermoFisher Kat.-Nr. NEIN. 703037; RRID: AB_2734813 (1:100), polyklonaler Kaninchen-Anti-Muc2-Antikörper (H-300), SCBT-Kat. NEIN. sc-15334 RRID: AB_2146667 (1:200) und Kaninchen-Anti-VIL1-IgG-Antikörper Sigma Aldrich Kat.-Nr. NEIN. HPA006885; RRID: AB_1080564 (1:100). Sekundäre Antikörperverdünnungen wurden in einer Verdünnung von 1:500 durchgeführt. Die folgenden Sekundärantikörper wurden verwendet: Goat anti-Mouse IgG (H + L) Cross-Absorbed Second Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen cat. NEIN. A11001; RRID: AB_2534069; Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L), kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Invitrogen Kat.-Nr. NEIN. A11008; RRID: AB_143165; Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L), kreuzabsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555 Invitrogen Kat.-Nr. NEIN. A21422; RRID: AB_2535844; Ziegen-Anti-Maus-IgG (H + L), kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 Invitrogen Kat.-Nr. NEIN. A11005; RRID: AB_2534073; Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H + L), kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594 Invitrogen Kat.-Nr. NEIN. A11012; RRID: AB_2534079; Kaninchen-Anti-Maus-IgG (H + L), kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 Invitrogen Kat.-Nr. NEIN. A11059; RRID: AB_142495. Wenn mehrere sekundäre Antikörper im selben Organoid-Färbeverfahren verwendet wurden, wurden die verwendeten sekundären Antikörper in derselben Wirtsspezies (Ziege) gezüchtet. Zur Visualisierung der Caspase 3/7-Aktivität wurde CellEvent Caspase 3/7 Green Detection Reagent (Invitrogen, C10723) nach 24-stündiger Infektion mit 10 µM zu lebenden Organoiden gegeben, dann wurden die Organoide bei 48 hpi fixiert und wie oben beschrieben gefärbt. Einzelne Zellen, die vollständig aus Organoiden extrudiert wurden, wurden auf die gleiche Weise wie intakte Organoide wie oben beschrieben gefärbt und abgebildet; Für diese Experimente wurde jedoch ein Trockenobjektiv mit 20-facher Vergrößerung verwendet.

Organoidbilder wurden mit der Volocity 3D Image Analysis Software (PerkinElmer) betrachtet, um eine 3D-Visualisierung jedes Organoids zu erhalten. Zellen innerhalb von Organoiden, die als extrudierend, apoptotisch und/oder infiziert galten, wurden manuell gezählt. Eine extrudierende Zelle wurde durch eine Zelle definiert, die an einem Organoid mit einem Kern befestigt war, der den Bürstensaum der Organoid-Mikrovillus-Bürste durchquert hat. In Experimenten, bei denen alle Zellen gezählt werden mussten, wurde die Gesamtzahl der Zellen in jedem Organoid gezählt, indem DAPI in Z-Stapelintervallen von 6 µm abgebildet wurde, um die Kerne jeder Organoidzelle in einer einzelnen Z-Ebene zu erfassen. Volocity wurde verwendet, um einzelne Kerne aus diesen einzelnen Z-Ebenen-Bildern mithilfe der 2D-Kernquantifizierungsfunktion zu quantifizieren.

In relevanten Experimenten wurde die Quantifizierung der verbleibenden nicht extrudierenden oder nicht infizierten Zellen berechnet, indem die Anzahl der manuell gezählten Zellen in jeder Gruppe von der Gesamtzahl der Zellen in jedem Organoid abgezogen wurde.

In Experimenten, bei denen vollständig extrudierte Zellen untersucht wurden, wurden einzelne Zellen anhand von 3D-Renderings von Bildern mit Z-Stapeln in Abständen von 1,8 µm identifiziert. Zur Identifizierung einzelner Zellen wurde die Volocity 3D Image Analysis Software (PerkinElmer) verwendet: Kerne wurden zunächst mithilfe der Quantifizierungsfunktion „Objekte finden“ identifiziert, die Objektfläche wurde mithilfe der Quantifizierungsfunktion „Objekte erweitern“ zweimal iterativ vergrößert, um jeden Kern zu umgeben, und die Signalintensität in jedem Kanal wurde erhöht mit der Funktion „Objekte messen“ erfasst. Objekte mit einer Summenintensität im vRNA-Kanal >2.500 wurden als infiziert angesehen.

Pharmakologische Verbindungen und Peptide wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Extrusion infizierter Zellen zu reduzieren. Bei allen Experimenten wurden die Organoide nach anfänglicher Virusimpfung und Waschschritten den Verbindungen ausgesetzt. Z-VAD-FMK (Pan-Caspase-Inhibitor, R&D Systems, 21631) und Para-Nitro-Blebbistatin (Myosin-II-Inhibitor, Cayman Chemical, 24171) wurden in wasserfreiem DMSO solubilisiert und infizierten Organoiden in Endkonzentrationen von 100 µM und 50 µM zugesetzt µM bzw. GsMTx4 (mechanosensitiver Ionenkanalinhibitor, Tocris, 4912/100U) wurde in Differenzierungsmedium solubilisiert und infizierten Organoiden in einer Endkonzentration von 20 µM zugesetzt. Für Experimente, in denen in DMSO gelöste Verbindungen enthalten waren, wurden die endgültigen DMSO-Konzentrationen in den Vertiefungen unter allen Bedingungen auf 0,5 % (v/v) standardisiert.

Fraktionierungen infizierter Organoidsuspensionen durch differenzielle Sedimentation wurden 8 Stunden nach der Infektion durchgeführt. Alle Proben wurden während der Fraktionierung bei 4 °C gehalten. Proben der gesamten Organoidsuspension (Whole Well-Proben) wurden vor allen Sedimentationsschritten gesammelt. Anschließend wurden die Organoide 10–15 Minuten lang durch Schwerkraft pelletiert (1 g). Die Proben wurden mit einem konfokalen Mikroskop untersucht, um die Pelletierung der Organoide zu bestätigen. Die Pellets, die intakte Organoide enthielten, wurden dreimal in DMEM gewaschen und schließlich für zukünftige Analysen (Organoidproben) in DMEM resuspendiert. Die Untersuchung der gesammelten Organoide ergab eine begrenzte Kontamination mit einzelnen Zellen (Erweiterte Daten, Abb. 5 und Ergänzungstabelle 4). Die Überstände, die extrudierte Zellen im Originalmedium enthielten (Zellen + Medienproben), wurden 3 Minuten lang bei 600 g weiter zentrifugiert, um Zellen und Medienproben zu erzeugen. Die Zellpellets wurden auf ähnliche Weise dreimal in DMEM gewaschen und für zukünftige Analysen (Zellproben) in DMEM resuspendiert. In diesen Zubereitungen wurden keine Organoide beobachtet. Die Überstände aus der 600-g-Schleuder wurden ebenfalls gesammelt (Medienproben). In Experimenten mit einem Spike-In von exogenem Virus wurden 106 PFU EV-A71-Virusstamm zu den Zellen + Medienproben hinzugefügt, um sicherzustellen, dass die Waschschritte ausreichend waren, um freie Viruskontaminationen aus Zellfraktionen zu entfernen, und die Waschschritte wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Alle Fraktionen wurden drei Zyklen des Einfrierens und Auftauens unterzogen, um das intrazelluläre Virus in zell- oder organoidhaltigen Fraktionen freizusetzen, bevor die Virustiter mittels Plaque-Assay bestimmt wurden.

Extrudierte Zellen aus infizierten Organoiden wurden wie in den oben genannten Fraktionierungsexperimenten gesammelt. Nach der Schwerkraftpelletierung zur Entfernung von Organoiden wurden die extrudierten Zellen durch ein 70-µm-Nylon-Mesh-Zellsieb geleitet. In Fällen, in denen beobachtet wurde, dass kleine Organoide durch ein 70-µm-Sieb flossen, wurden diese durch eine zusätzliche 10-g-Zentrifugation für 3 Minuten entfernt. Während des dritten (letzten) Waschens der extrudierten Zellen wurde kaltes Differenzierungsmedium zum Waschen der Zellen verwendet. Der Überstand dieser Wäsche wurde aufbewahrt und als Inokulum bei parallelen Infektionen verwendet, um die Viruskonzentrationen zu überwachen, die möglicherweise auf eine unvollständige Entfernung zellfreier Viren zurückzuführen sind. Das Pellet mit den extrudierten Zellen wurde in kaltem Differenzierungsmedium resuspendiert und sofort als Inokulum für neue Zellen oder Organoide verwendet. Sekundär infizierte RD-Zellen wurden 1–2 Tage vor der Infektion in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät, unmittelbar vor der Infektion einmal mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Ca+2 und Mg+2 (DPBS++) gewaschen und 1 Stunde lang bei 37 °C mit beimpft 150 µl Waschüberstand oder extrudierte Zellen und erneutes Waschen mit DPBS++ vor Zugabe von 1 ml RD-Zellmedium pro Vertiefung. Das Zellmedium wurde unmittelbar nach der Infektion (1 h) oder nach 16 h der Infektion gesammelt und bei –20 °C eingefroren. Sekundärinfektionen von Organoiden wurden mit den oben für EV-A71-Infektionen von Organoiden beschriebenen Methoden durchgeführt; Da jedoch die unmittelbare Verwendung extrudierter Zellen als Inokulum es unmöglich machte, den Virustiter von Inokulums vor ihrer Verwendung bei Sekundärinfektionen zu quantifizieren, wurden sekundär infizierte Zellen nicht zur Bestimmung des MOI vor der Infektion gezählt.

Die statistische Datenanalyse wurde in GraphPad Prism 9 durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Experimente drei unabhängige Male unter Verwendung mehrerer unterschiedlicher organoider Spenderlinien durchgeführt, um spenderspezifische Unterschiede zu berücksichtigen. In Experimenten, für die Daten aus einem repräsentativen Experiment gezeigt werden, wurden experimentelle Ergebnisse mit Organoiden aus einer weiteren Spenderlinie reproduziert. Alle gezeigten Mikroskopiebilder sind repräsentativ für Experimente, bei denen mindestens zehn Organoide mit ähnlichen Ergebnissen untersucht wurden. Für quantitative Mikroskopiedaten im Haupttext (Abb. 2d, e, 3f und 4f) wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt, bei denen jeweils mindestens zehn Organoide untersucht wurden; Für statistische Tests wurden Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten verwendet. In Mikroskopiediagrammen stellen Kreise Messungen einzelner Organoide (technische Replikate) dar, während Dreiecke Messungen darstellen, die durch die Akkumulation von Daten aller Organoide aus demselben Experiment (biologische Replikate) erhalten wurden. Die Farben der Symbole klassifizieren unabhängige Experimente. Dieses hier verwendete „SuperPlot“-Grafikformat wurde ausführlich von Lord et al.59 beschrieben. In allen Diagrammen werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Informationen zu spezifischen statistischen Tests in jeder Analyse finden Sie in den Legenden der Abbildungen. Bei den verwendeten Gaußschen statistischen Tests wurde davon ausgegangen, dass die Datenverteilung normal ist, dies wurde jedoch nicht formal getestet. Genaue P-Werte statistischer Tests finden Sie in den Quelldatendateien. Zur Vorabbestimmung der Stichprobengrößen wurden keine statistischen Methoden verwendet, aber unsere Stichprobengrößen ähneln denen in früheren Veröffentlichungen9,10,13.

Innerhalb jedes unabhängigen Experiments wurden Proben (Organoide) zufällig Versuchsgruppen zugeordnet. Um die Möglichkeit von Bedienerfehlern zu verringern, wurde die Organisation der dargestellten Versuchsbedingungen (z. B. Plattenlayout) nicht randomisiert. Die Erfassung der Virustiterdaten (Zählung der Plaques) erfolgte mit Randomisierung und Verblindung der Proben durch den Prüfer. Aufgrund der zeitintensiven Erhebung mikroskopischer Daten wurde auf Randomisierung und Verblindung verzichtet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

In dieser Studie wurden keine Datensätze mit vorgeschriebener Hinterlegung erstellt. Alle grafischen Rohdaten und zugehörigen statistischen Tests wurden als Quelldatendateien zur Verfügung gestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Weitere Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, einschließlich roher Mikroskopie-Bilddateien, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Der Code ist nicht anwendbar.

Taylor, MP, Burgon, TB, Kirkegaard, K. & Jackson, WT Rolle von Mikrotubuli bei der extrazellulären Freisetzung von Polioviren. J. Virol. 83, 6599–6609 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bird, SW, Maynard, ND, Covert, MW & Kirkegaard, K. Nichtlytische Virusausbreitung, verstärkt durch Autophagiekomponenten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 111, 13081–13086 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hsu, N.-Y. et al. Durch die virale Reorganisation des Sekretionswegs entstehen unterschiedliche Organellen für die RNA-Replikation. Zelle 141, 799–811 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feng, Z. et al. Ein pathogenes Picornavirus erlangt eine Hülle, indem es Zellmembranen kapert. Natur 496, 367–371 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Santiana, M. et al. Vesikelverhüllte Viruscluster sind optimale Einheiten für die interorganismische Virusübertragung. Cell Host Microbe 24, 208–220.e8 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lanik, W., Mara, M., Mihi, B., Coyne, C. & Good, M. Stammzellbasierte Modelle viraler Infektionen im Magen-Darm-Trakt. Viren 10, 124 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D. & Wolthers, KC Geben Sie Mut: Darmorganoidmodelle zur Untersuchung viraler Infektionen. Viren 12, 1288 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Sato, T. et al. Langfristige Expansion epithelialer Organoide aus menschlichem Dickdarm, Adenom, Adenokarzinom und Barrett-Epithel. Gastroenterology 141, 1762–1772 (2011).

Drummond, CG et al. Enteroviren infizieren menschliche Enteroide und induzieren auf zelllinienspezifische Weise antivirale Signale. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 114, 1672–1677 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Good, C., Wells, AI & Coyne, CB Typ-III-Interferon-Signalisierung schränkt die Enterovirus-71-Infektion von Becherzellen ein. Wissenschaft. Adv. 5, eaau4255 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, X. et al. Menschliche Darmorganoide rekapitulieren enterale Infektionen von Enteroviren und Coronaviren. Stem Cell Rep. 16, 1–12 (2021).

Co, JY, Margalef-Català, M., Monack, DM & Amieva, MR Kontrolle der Polarität menschlicher Magen-Darm-Organoide zur Untersuchung der Epithelbiologie und von Infektionskrankheiten. Nat. Protokoll. 16, 5171–5192 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Co, JY et al. Kontrolle der Epithelpolarität: ein menschliches Enteroidmodell für Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen. Cell Rep. 26, 2509–2520 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heybrock, S. et al. Das lysosomale integrale Membranprotein-2 (LIMP-2/SCARB2) ist am lysosomalen Cholesterinexport beteiligt. Nat. Komm. 10, 3521 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yamayoshi, S. et al. Scavenger-Rezeptor B2 ist ein zellulärer Rezeptor für Enterovirus 71. Nat. Med. 15, 798–801 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Leblond, CP & Walker, BE Erneuerung von Zellpopulationen. Physiol. Rev. 36, 255–276 (1956).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Darwich, AS, Aslam, U., Ashcroft, DM & Rostami-Hodjegan, A. Metaanalyse des Umsatzes von Darmepithelien bei präklinischen Tierarten und Menschen. Arzneimittel-Metabol. Dispos. 42, 2016–2022 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

Dwivedi, VK et al. Replikationsstress fördert die Zelleliminierung durch Extrusion. Natur 593, 591–596 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bras-Pereira, C. & Moreno, E. Mechanistischer Zellwettbewerb. Curr. Meinung. Zellbiol. 51, 15–21 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Rosenblatt, J., Raff, MC & Cramer, LP Eine Epithelzelle, die zur Apoptose bestimmt ist, signalisiert ihren Nachbarn, sie durch einen Aktin- und Myosin-abhängigen Mechanismus auszustoßen. Curr. Biol. 11, 1847–1857 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Madara, JL Aufrechterhaltung der makromolekularen Barriere an Zellextrusionsstellen im Darmepithel: physiologische Neuordnung von Tight Junctions. J. Mitglied Biol. 116, 177–184 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Guan, Y. et al. Umverteilung des Tight-Junction-Proteins ZO-1 während der physiologischen Ablösung von Darmepithelzellen der Maus. Bin. J. Physiol. Zellphysiologie. 300, C1404–C1414 (2011).

Andrade, D. & Rosenblatt, J. Apoptotische Regulierung der epithelialen Zellextrusion. Apoptosis 16, 491–501 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boersma, S. et al. Translations- und Replikationsdynamik einzelner RNA-Viren. Zelle 183, 1–16 (2020).

Artikel Google Scholar

Chang, Y.-L., Ho, B.-C., Sher, S., Yu, S.-L. & Yang, P.-C. miR-146a und miR-370 koordinieren die durch Enterovirus 71 induzierte Zellapoptose, indem sie auf SOS1 und GADD45β abzielen. Zelle. Mikrobiol. 17, 802–818 (2015).

Chi, C. et al. Robuste antivirale Reaktionen auf eine Enterovirus-71-Infektion in menschlichen Darmepithelzellen. Virus Res. 176, 53–60 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, M.-L. et al. Die EV71-3C-Protease induziert Apoptose durch Spaltung von hnRNP A1, um die Apaf-1-Translation zu fördern. PLoS ONE 14, e0221048 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liang, C.-C. et al. Aktivierung und Apoptose menschlicher Endothelzellen, hervorgerufen durch eine Enterovirus-71-Infektion. J. Med. Virol. 74, 597–603 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Eisenhoffer, GT et al. Crowding induziert die Extrusion lebender Zellen, um die homöostatische Zellzahl im Epithel aufrechtzuerhalten. Natur 484, 546–549 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gudipaty, SA & Rosenblatt, J. Extrusion von Epithelzellen: Wege und Pathologien. Semin. Zellentwickler. Biol. 67, 132–140 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Knodler, LA et al. Verbreitung invasiver Salmonellen durch bakteriell induzierte Extrusion von Schleimhautepithelien. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 107, 17733–17738 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suchyna, TM et al. Identifizierung eines Peptidtoxins aus dem Spinnengift von Grammostola spatulata, das kationenselektive dehnungsaktivierte Kanäle blockiert. J. Gen. Physiol. 115, 583–598 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bae, C., Sachs, F. & Gottlieb, PA Der mechanosensitive Ionenkanal Piezo1 wird durch das Peptid GsMTx4 gehemmt. Biochemistry 50, 6295–6300 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Várkuti, BH et al. Ein hochlösliches, nicht phototoxisches, nicht fluoreszierendes Blebbistatin-Derivat. Wissenschaft. Rep. 6, 26141 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuipers, D. et al. Die Epithelreparatur ist ein zweistufiger Prozess, der zuerst von absterbenden Zellen und dann von ihren Nachbarn gesteuert wird. J. Cell Sci. 127, 1229–1241 (2014).

CAS PubMed Google Scholar

Bastounis, EE et al. Durch angeborene Immunsignale ausgelöster mechanischer Wettbewerb treibt die kollektive Extrusion bakteriell infizierter Epithelzellen voran. Entwickler Zelle 56, 443–460.e11 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y.-F. et al. Ein an Mäuse angepasster Stamm des Enterovirus 71 verursacht bei Mäusen nach einer oralen Infektion neurologische Erkrankungen. J. Virol. 78, 7916–7924 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, S.-C. et al. Der durch Sumoylierung geförderte Abbau von Enterovirus 71 3C korreliert mit einer Verringerung der Virusreplikation und der Zellapoptose. J. Biol. Chem. 286, 31373–31384 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parker, A. et al. Eine erhöhte Apoptose beeinträchtigt den Epithelzellumsatz und verkürzt die Zotten bei TNF-bedingten Darmentzündungen. Zelltod-Dis. 10, 108 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gudipaty, SA et al. Mechanische Dehnung löst durch Piezo1 eine schnelle Teilung der Epithelzellen aus. Natur 543, 118–121 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ge, J. et al. Architektur des mechanosensitiven Piezo1-Kanals von Säugetieren. Natur 527, 64–69 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schlegel, A. & Kirkegaard, K. in Human Enterovirus Infections (Hrsg. Rotbart, HA) 135–154 (ASM Press, 2014).

Armer, H. et al. Das Maul- und Klauenseuchevirus, jedoch nicht das Rinderenterovirus, zielt über das Nichtstrukturprotein 3Cpro auf das Zytoskelett der Wirtszelle. J. Virol. 82, 10556–10566 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Badorff, C. et al. Enterovirale Protease 2A spaltet Dystrophin: Hinweise auf eine Störung des Zytoskeletts bei einer erworbenen Kardiomyopathie. Nat. Med. 5, 320–326 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cudmore, S., Reckmann, I. & Way, M. Virale Manipulationen des Aktin-Zytoskeletts. Trends Mikrobiol. 5, 142–148 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cox, CD et al. Die Entfernung des mechanoprotektiven Einflusses des Zytoskeletts zeigt, dass PIEZO1 durch die Spannung der Doppelschicht gesteuert wird. Nat. Komm. 7, 10366 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, J. et al. Anbindung von Piezokanälen an das Aktin-Zytoskelett zur Mechanotransduktion über den Cadherin-β-Catenin-Mechanotransduktionskomplex. Cell Rep. 38, 110342 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, Y.-H. et al. Phosphatidylserin-Vesikel ermöglichen eine effiziente En-bloc-Übertragung von Enteroviren. Zelle 160, 619–630 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, JE et al. Komplexität und Ultrastruktur infektiöser extrazellulärer Vesikel aus Zellen, die mit unbehüllten Viren infiziert sind. Wissenschaft. Rep. 10, 7939 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Erickson, AK et al. Bakterien erleichtern die Koinfektion von Säugetierzellen mit Darmviren und fördern die genetische Rekombination. Cell Host Microbe 23, 77–88.e5 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brown, JJ et al. Durch Reoviren induzierte Apoptose im Darm begrenzt die Entstehung einer Darminfektion. J. Virol. 92, e02062–17 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, S. et al. Das Nlrp9b-Inflammasom schränkt die Rotavirus-Infektion in Darmepithelzellen ein. Natur 546, 667–670 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pickles, RJ & DeVincenzo, JP Respiratory Syncytial Virus (RSV) und seine Neigung, Bronchiolitis zu verursachen. J. Pathol. 235, 266–276 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Eckardt-Michel, J. et al. Das Fusionsprotein des Respiratory Syncytial Virus löst die p53-abhängige Apoptose aus. J. Virol. 82, 3236–3249 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hippee, CE et al. Das Masernvirus verlässt das Epithel der menschlichen Atemwege innerhalb verlagerter, metabolisch aktiver Infektionszentren. PLoS Pathog. 17, e1009458 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, W.-HW, Tsay, AJ, Lalime, EN, Pekosz, A. & Griffin, DE Primär differenzierte respiratorische Epithelzellen reagieren auf eine Infektion mit dem apikalen Masernvirus, indem sie mehrkernige Riesenzellen abstoßen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 118, e2013264118 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miyoshi, H. & Stappenbeck, TS In-vitro-Expansion und genetische Modifikation von gastrointestinalen Stammzellen in Sphäroidkulturen. Nat. Protokoll. 8, 2471–2482 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, S.-W., Wang, Y.-F., Yu, C.-K., Su, I.-J. & Wang, J.-R. Mutationen in den Kapsidproteinen VP2 und VP1 erhöhen die Infektiosität und Mausletalität des Enterovirus 71 durch Virusbindung und Verstärkung der RNA-Akkumulation. Virology 422, 132–143 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lord, SJ, Velle, KB, Mullins, RD & Fritz-Laylin, LK SuperPlots: Vermittlung von Reproduzierbarkeit und Variabilität in der Zellbiologie. J. Cell Biol. 219, e202001064 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken J. Co, M. Margalef-Català und K.-F. Weng für den Austausch von Fachwissen und Reagenzien, C. Kuo (Stanford University) für die großzügige Bereitstellung organoider Zelllinien, J. Theriot, M. Ott und B. Burkholder für die wissenschaftliche Diskussion sowie P. Sarnow und J. Carette für die kritische Lektüre von das Manuskript. Illustrationen wurden in Biorender.com erstellt. Diese Arbeit wurde vom Chan-Zuckerberg BioHub (KK), BioX der Stanford University (ARC), dem Novo Nordisk Foundation Grant NNF19OC0056411 (MRA) und den National Institutes of Health Grants R01AI13491204 (KK), 5U19AI116484-06 (MRA), T32GM007276 ( JM) und T32AI1007328 (JM). Die Geldgeber hatten keinen Einfluss auf das Studiendesign, die Datenerfassung und -analyse, die Entscheidung zur Veröffentlichung oder die Erstellung des Manuskripts.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Manuel R. Amieva, Karla Kirkegaard.

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Stanford University, Stanford, CA, USA

Jasmine Moshiri, Manuel R. Amieva und Karla Kirkegaard

Abteilung für Genetik, Stanford University, Stanford, CA, USA

Ailsa R. Craven, Sarah B. Mixon und Karla Kirkegaard

Abteilung für Pädiatrie, Stanford University, Stanford, CA, USA

Manuel R. Amieva

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

JM konzipierte, entwarf und führte Experimente durch, analysierte Daten und verfasste das Originalmanuskript. KK war an der Konzeption der vorgeschlagenen Forschung und der Gestaltung von Experimenten beteiligt. ARC hat zu den Experimenten in Abb. beigetragen. 1b und 5b–i und durchgeführte Experimente in den Extended Data Abbs. 2 und 7. SM führte Mikroskopie für Abb. 4 und Extended Data Abb. 3 durch. KK und MRA überwachten gemeinsam die Forschung und beteiligten sich an der Interpretation der Ergebnisse. KK, MRA und JM haben Fördermittel eingeworben. JM, KK und MRA haben das Manuskript bearbeitet und überarbeitet.

Korrespondenz mit Karla Kirkegaard.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt Nihal Altan-Bonnet, Stanley Perlman und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Durch Immunfluoreszenz wurde beobachtet, dass mit Poliovirus Typ 1 (Mahoney) infizierte Zellen aus Organoiden extrudierten. (ab) Dickdarmorganoide, infiziert mit einem MOI = 1 PFU/Zelle für 42 Stunden. MOI wurde durch Virustiter auf HeLa-Zellen bestimmt. Maßstabsbalken entsprechen 10 μm.

Differenzierte Kolonoide mit basolateraler Organoidpolarität wurden mit EV-A71 infiziert und 8 Stunden nach der Infektion durch Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. (a) Eine starke F-Actin-Färbung des apikalen Mikrovillus-Bürstenrandes wurde im Innenlumen infizierter Kolonoiden beobachtet. Virusinfizierte Zellen können sowohl innerhalb der Epithelschicht als auch im apikalen Lumen beobachtet werden. (b, c) EV-A71-infizierte Zellen wurden apikal in das Innenlumen basolateraler Kolonoide extrudiert. Maßstabsbalken entsprechen 10 μm.

(a) Infizierte Organoide wurden zu bestimmten Zeitpunkten im ersten Infektionszyklus fixiert und die Anzahl der infizierten und nicht infizierten Zellen wurde mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie gezählt. Jeder Punkt stellt den Anteil infizierter Zellen innerhalb eines einzelnen Organoids dar; Dreiecke stellen Werte dar, die für jeden Zeitpunkt über alle Organoide gemittelt wurden. Ein Experiment mit N = 10 quantifizierten Organoiden pro Zeitpunkt. Ein Spitzenwert im Anteil infizierter Zellen innerhalb der Organoide trat bei 7 hpi auf und ging nach 9 hpi zurück. Die in diesem Diagramm dargestellten Rohzellzahlen werden in der Ergänzungstabelle 2 angezeigt. (b–d) Repräsentative infizierte Zellen zu jedem Zeitpunkt. Extrudierende infizierte Zellen enthalten unabhängig vom visualisierten Zeitpunkt ein ähnlich reichliches vRNA-Signal. Maßstabsbalken entsprechen 10 μm.

Quelldaten

Zellen, die in Gegenwart des fluorogenen Caspase-3/7-Substrats CellEvent vollständig aus infizierten Kolonoiden extrudiert worden waren, wurden bei 48 hpi gesammelt, fixiert und durch Fluoreszenzmikroskopie bei 20-facher Vergrößerung untersucht. (a) 3D-Renderings der abgebildeten Zellen wurden mit der Bildanalysesoftware Volocity visualisiert. Infizierte Zellen sind von gelben Kästchen umgeben. (b) Einzelne Zellen wurden aus 20 einzigartigen Sichtfeldern wie in A unter Verwendung rechnerischer Messwerkzeuge in Volocity identifiziert. Die Daten wurden von N = 743 einzelnen Zellen gesammelt. Zellen mit Pixelintensitäten von mehr als 1,5 pro Kubikmikrometer im vRNA-Kanal wurden als infiziert identifiziert; N = 39 infizierte Zellen, 5,2 % der Gesamtzahl. (c) Die Caspase-3/7-Aktivität der in B definierten Zellen wurde verglichen. Die Caspase-Aktivität in infizierten Zellen war vergleichbar mit der von nicht infizierten Zellen; ungepaarter, zweiseitiger t-Test; Daten dargestellt als Mittelwert ± SD; N = 39 infizierte Zellen; N = 704 nicht infizierte Zellen.

Quelldaten

Nach der Fraktionierung der Organoidkulturen wurden alle Fraktionen visuell mit einem Gewebekulturmikroskop untersucht, um die Sammlung der Zielpopulationen zu beurteilen. (a) Die visuelle Untersuchung der Organoidfraktion bei 40-facher Vergrößerung bestätigt, dass Organoide mit Schwerkraftpellet (1 xg) gesammelt werden. (b) In A hervorgehobener Bereich. Einzelne Zellen waren auch in geringer Häufigkeit in der Organoidfraktion vorhanden (Pfeile zeigen Beispiele an), möglicherweise ein Ergebnis der anhaltenden Zellextrusion aus Organoiden während der Fraktionierung (Pfeilspitzen).

Wir stellen zwei Hypothesen für mögliche Mittel zur Aktivierung mechanosensitiver Ionenkanäle in infizierten Zellen auf, die die Extrusion infizierter Zellen vorantreiben können. Mechanosensitive Ionenkanäle wie Piezo1 können durch (a) externe Kompressionskräfte aktiviert werden, die eine Membranverformung induzieren, sowie (b) zelleigene mechanische Kräfte, die durch angebundene Zytoskelettfilamente übertragen werden. (c, d) Wir präsentieren konzeptionelle Modelle dafür, wie eine Virusinfektion eine Kanalaktivierung sowohl über von außen nach innen gerichtete als auch über zelleigene Kräfte induzieren kann. (c) In nicht infizierten Zellen sorgen Zytoskelettfilamente für strukturelle Unterstützung unter der Plasmamembran und reduzieren die Membranverformung durch zellextrinsische Kräfte. In infizierten Zellen, in denen Aktin neu angeordnet wird, fehlt diese strukturelle Unterstützung möglicherweise, was zu „weicheren“ Membranen führt, die sich leichter durch äußere Druckkräfte verformen lassen. (d) Im Force-through-Filament-Modell werden zelleigene mechanische Kräfte über die Anbindung an Zytoskelettfilamente auf Piezokanäle übertragen. In infizierten Zellen können Zytoskelettumlagerungen Kräfte direkt auf angebundene Piezokanäle übertragen und so eine Aktivierung auslösen. Adaptiert aus „PIEZO Channels: How Do They Allow Mechanosensation?“, von BioRender.com (2022). Abgerufen von https://app.biorender.com/biorender-templates.

Apikal nach außen gerichtete, differenzierte Epithelorganoide aus menschlichem (a) Magen- und (b) Zwölffingerdarmgewebe wurden mit Enterovirus A-71 infiziert. Der Virustiter wurde über die Zeit mittels Plaque-Assay überwacht. Daten von einem einzigen Spender und Experiment pro Panel werden in technischer Dreifachausfertigung angezeigt. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte ± SD.

Quelldaten

Ergänzende Tabellen 1–4.

Statistische Quelldaten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Moshiri, J., Craven, AR, Mixon, SB et al. Mechanosensitive Extrusion von Enterovirus A71-infizierten Zellen aus Dickdarmorganoiden. Nat Microbiol 8, 629–639 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01339-5

Zitat herunterladen

Eingegangen: 31. Juli 2022

Angenommen: 10. Februar 2023

Veröffentlicht: 13. März 2023

Ausgabedatum: April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01339-5

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Nachricht