Isolierung und molekulare Charakterisierung neu auftretender Vogel-Reovirus-Varianten und neuartiger Stämme in Pennsylvania, USA, 2011

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 14727 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Infektionen mit dem Aviären Reovirus (ARV) bei Broiler- und Putenherden haben seit 2011 in Pennsylvania (PA) zu erheblichen klinischen Erkrankungen und wirtschaftlichen Verlusten geführt. Die meisten ARV-infizierten Vögel litten an schwerer Arthritis, Tenosynovitis, Perikarditis und Wachstumsstörungen oder dem Runting-Stunting-Syndrom (RSS). Bei ARV-befallenen Herden wurde eine hohe Morbidität (bis zu 20 % bis 40 %) beobachtet und die Sterblichkeit der Herde betrug gelegentlich bis zu 10 %. Im Jahr 2011 wurden in PA erstmals ARV-Infektionen bei Puten diagnostiziert. Von 2011 bis 2014 wurden insgesamt 301 ARV-Isolierungen bei betroffenem PA-Geflügel durchgeführt. Die molekulare Charakterisierung des Sigma-C-Gens von 114 Feldisolaten, die die meisten ARV-Ausbrüche darstellen, ergab, dass sich nur 21,93 % der 114 sequenzierten ARV-Isolate im selben Genotypisierungscluster (Cluster 1) befanden wie die ARV-Impfstoffstämme (S1133, 1733 und 2048). ), während 78,07 % der sequenzierten Isolate in den Genotypisierungsclustern 2, 3, 4, 5 und 6 (die sich von den Impfstämmen unterschieden) lagen und neu auftretende ARV-Varianten darstellten. Insbesondere der Genotypisierungscluster 6 war ein neuer ARV-Genotyp, der zum ersten Mal in 10 neuen PA-ARV-Varianten von Feldisolaten identifiziert wurde.

Aviäre Reoviren (ARVs) sind in der Natur weit verbreitet und werden mit einer Vielzahl von Krankheiten in Verbindung gebracht, die verschiedene Vogelarten1,2 betreffen, darunter Hühner3,4, Fasane5, Truthähne6,7, Enten8,9,10, Gänse11, Tauben12, Wachteln13,14, 15, Raubvögel16 und Papageienvögel17. Allerdings werden die meisten klinischen Erkrankungen aufgrund von ARV-Infektionen bei Broilern und Broiler-Elterntieren beobachtet18. Bei jungen Broilern sind die häufigsten klinischen Syndrome Tenosynovitis, Malabsorptionssyndrom, Runting-Stunting-Syndrom (RSS), Probleme mit Darmerkrankungen und Immunsuppression19,20,21,22,23. ARV-Infektionen bei Hausgeflügel haben mehrere wirtschaftlich bedeutende Auswirkungen. Dazu gehören eine erhöhte Sterblichkeit, ein allgemeiner Leistungsmangel, eine verringerte Gewichtszunahme, eine schlechte Futterverwertung, eine ungleichmäßige Wachstumsrate, eine verringerte Marktfähigkeit der betroffenen Vögel, virale Arthritis/Tenosynovitis und Sekundärinfektionen durch andere Viren oder Bakterien2,22.

ARVs gehören zur Gattung Orthoreovirus in der Familie der Reoviridae24,25. Sie enthalten 10 Genomsegmente doppelsträngiger RNA (dsRNA), darunter 3 Größenklassen L (groß), 3 M (mittel) und 4 S (klein), basierend auf der elektrophoretischen Mobilität der Segmente26. Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass das vom S1-Genomsegment kodierte Sigma-C-Protein das Zellbindungsprotein und eine wichtige antigene Determinante für ARVs ist; Das S1-Genomsegment bestehender Hühner-ARV-Stämme ist gut charakterisiert und in Viren von Hühnern gut konserviert27,28,29,30. ARV-Stämme aus der Türkei, die in den letzten Jahren im Mittleren Westen der USA zirkulierten, unterscheiden sich antigenisch von ARV-Stämmen aus Hühnern. Die aus der Türkei stammenden ARV-Stämme gelten als separater Virussubtyp innerhalb der Orthoreovirus-Gattung31,32,33.

Seit 2011 sind in Pennsylvania (PA), USA, neu auftretende ARV-Infektionen aufgetreten, die seitdem zu schweren Krankheiten und wirtschaftlichen Verlusten in der Geflügelindustrie von PA geführt haben. Eine konservative Schätzung der Kosten dieser ARV-Infektionen bei Masthühnern liegt bei 23.000 US-Dollar pro betroffener Herde (28.000 Vögel/Herde), und ein Truthahnunternehmen schätzte die Verluste in einem Jahr auf 3 Millionen US-Dollar. Die Impfung gegen ARV mit konventionellen Impfstoffen wurde vor den beobachteten Ausbrüchen bei Legehennen- und Masthähnchenhaltern praktiziert. Diese herkömmlichen Impfstoffe schienen jedoch keinen Schutz gegen ARV-Feldinfektionen zu bieten. Bis zu diesem Zeitpunkt waren Putenzuchtherden keine ARV-Impfstoffe verabreicht worden. In kommerziellen Legehennen-, Masthähnchen- oder Putenbeständen wurden keine ARV-Impfungen durchgeführt. Seit der Entdeckung von Varianten-ARV-Infektionen in kommerziellen Puten- und Broilerherden greift die Geflügelindustrie auf die Impfung von Zuchtherden mit abgetöteten autogenen ARV-Impfstoffen zurück.

ARV-Infektionen bei Masthühnern und Puten werden seit 2011 in PA zunehmend diagnostiziert und werden weiterhin beobachtet. Zwischen 2011 und 2014 wurde durch Virusisolierung in unserem Labor bei 301 Fällen (Herden) eine ARV-Infektion bestätigt. Bei den meisten ARV-positiven Fällen handelte es sich um erkrankte Masthähnchen und Puten mit schwerer Arthritis/Tenosynovitis, die mehrere Gelenke und Sehnen der Beine einschließlich Kniegelenk, Sprunggelenk und Fußballen betraf, wobei sich die Entzündung auf die umgebende Muskulatur ausbreitete. Häufig lag eine hohe Morbidität (20–40 %) und Mortalität (bis zu 10 %) vor. In diesem Artikel werden unsere Diagnose- und Forschungsergebnisse zur Isolierung und molekularen Charakterisierung dieser ARV-Varianten aus PA, USA, beschrieben.

ARV-Infektionen haben seit 2011 zu erheblichen klinischen Erkrankungen und wirtschaftlichen Verlusten bei PA-Geflügel geführt, insbesondere bei Masthühnern und Puten. Im Juni 2011 wurden in PA erstmals ARV-Infektionen bei Puten diagnostiziert (Tabelle 1, Nr. 54: Reo/PA/Turkey/12883/11). ARV-infizierte Broiler- und Putenherden leiden unter schwerer Lahmheit und Spreizbeinen aufgrund einer Tenosynovitis, die sich über die Femorotibiotarsal- und Intertarsalgelenke sowie den plantaren Mittelfußbereich erstreckt, und in einigen Fällen auch an einer Entzündung, die sich auf die umgebende Muskulatur ausbreitet (Abb. 1a,b). Der Krankheitsausbruch trat bei Broilerherden üblicherweise im Alter zwischen 2 und 4 Wochen und bei Putenherden im Alter von 10 Wochen oder älter auf. Eine hohe Morbidität (bis zu 20–40 %) der ARV-infizierten Vögel in einem Schwarm wurde häufig beobachtet und die Mortalität betrug in den schwersten Fällen bis zu 10 %. Das Vorliegen schwerwiegender grober pathologischer Läsionen umfasste deutliche Schwellungen, Ödeme, Blutungen in den Sehnen und Sehnenscheiden sowie in chronischeren Fällen einen Sehnenriss über die gesamte Dicke mit schwerer Blutung (Abb. 1c, d). Bei einigen betroffenen Vögeln traten auch Perikarditis-Läsionen auf (Abb. 1e). Mikroskopisch waren Lymphozyten und Plasmazellen die vorherrschenden Entzündungszelltypen in den betroffenen Geweben (Abb. 1f).

Insgesamt wurden in unserem Labor von 2011 bis 2014 301 ARV-Feldisolate gewonnen, hauptsächlich aus Sehnen und einige aus anderen Geweben (Herzen, Lebern oder Därme) von ARV-infizierten Vögeln. Die Virusisolierungen wurden in einschichtigen LMH-Zellkulturen (ATCC CRL-2113) durchgeführt (Abb. 2, 1a). Von den 301 ARV-Feldisolaten stammten 206 von Broilern, 18 von Legehennen, 63 von Truthähnen, 7 von Chukar-Rebhühnern, 4 von Perlhühnern, 2 von Ringelfasanen und 1 von Wachteln (Ergänzungstabelle 1). Riesige oder „blütenartige“ zytopathische Effekte (CPEs) waren charakteristisch für ARV-Infektionen in LMH-Zellkulturen (Abb. 2, 1b–d). Alle 301 ARV-Isolate wurden durch riesige oder „blütenähnliche“ CPE-positive Zellen bestätigt, die anschließend durch den Fluoreszenzantikörpertest (FA) unter Verwendung eines fluoreszierenden ARV-Antikörpers positiv auf ARV gefärbt wurden (Abb. 2b–d). Die Inkubationszeiten für CPE variierten: Der früheste CPE wurde 24 Stunden nach der Inokulation (pi) beobachtet; das späteste wurde in einigen Fällen nach 4 aufeinanderfolgenden Zellpassagen beobachtet; und bei den meisten ARV-positiven Fällen wurde CPE 3–5 Tage pi innerhalb von 2–3 aufeinanderfolgenden Zellpassagen beobachtet.

Insgesamt wurden 114 ARV-Feldisolate, die zwischen 2011 und 2014 ARV-Fälle bei Broilern, Legehennen, Truthähnen, Fasanen und Perlhühnern diagnostizierten, für die molekulare Charakterisierung des S1-Segments des σC-Gens ausgewählt (Tabelle 1). Jedes der 114 ARV-Isolate wurde durch S1-basierte RT-PCR unter Verwendung von P1/P4-Primern erfolgreich als 1088-bp-Fragment amplifiziert34. Das PCR-Produkt wurde dann gereinigt und zur S1-Gensequenzierung an die Penn State Genomics Core Facility übermittelt.

Die Konstruktion phylogenetischer Bäume und die Analyse zur Erhaltung der S1-Segmentsequenzen des σC-Gens der 114 ARV-Feldstämme (Tabelle 1) mit weiteren 28 Referenzstammsequenzen (Ergänzungstabelle 2), die von der GenBank abgerufen wurden, ergaben, dass die 114 ARV-Feldstämme aus PA-Geflügel isoliert wurden wurden in 6 Genotypisierungscluster oder Genotypen eingeteilt (Abb. 3). Von den 114 Feldstämmen in diesen Clustern befanden sich 25 (21,93 %) im selben Cluster (Cluster 1) wie die Standard-ARV-Impfstoffstämme (S1133, 1733, 2048); 38 (33,33 %) in Cluster 2; 7 (6,14 %) in Cluster 3 und 4; 27 (23,68 %) in Cluster 5; und 10 (8,77 %) in Cluster 6 (Tabelle 2; Abb. 3). Insbesondere wurde der Genotypisierungscluster 6 oder Genotyp 6 zum ersten Mal in 10 bei PA-Geflügel nachgewiesenen ARV-Feldstämmen identifiziert, und diese Stämme waren neu und unterschieden sich von allen zuvor veröffentlichten ARV-Referenzstämmen.

Phylogenetische Bäume, die 6 Genotypisierungscluster (6 codierte Farben) der 114 in Pennsylvania, USA, 2011–2014 isolierten Feldstämme des Aviären Reovirus (ARV) zeigen.

Die Analyse basierte auf 300 Aminosäuresequenzen von σC-Gensequenzen. Zweiglängen sind proportional zu den evolutionären Abständen zwischen Sequenzen. Die Skalen stellen Nukleotidsubstitutionen pro Position dar. Die Namen der 28 aus GenBank abgerufenen ARV-Referenzstämme befinden sich nur in den Clustern 1–5 (fett gedruckt, um sie von den Feldstämmen zu unterscheiden).

Ein paarweiser Vergleich der Vorhersage der Aminosäuresequenz (aa) (1 bis 300) wurde durchgeführt, um den Grad der Sequenzidentität der Homologen der σC-Gene zwischen den 114 PA-ARV-Feldstämmen und den 28 aus der GenBank entnommenen ARV-Referenzstämmen zu untersuchen (Abb . 3). Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass die aa-Sequenzidentitäten der σC-kodierenden Gene zwischen den 114 PA-ARV-Feldstämmen dramatisch variieren (40 % bis 100 %); Die AA-Ähnlichkeiten zwischen zwei der sechs Genotypisierungscluster betrugen weniger als 60,8 %. Es wurden unterschiedliche Grade an Unterschieden zwischen den AA-Ähnlichkeiten innerhalb jedes Clusters beobachtet.

Die Klassifizierung der ARV-Genotypisierungscluster und -subcluster basierte auf den Bootstrap-Werten (Analyse mit 1000 Pseudoreplikaten). Als die 114 Feldstämme und 28 Referenzstämme zusammen dargestellt wurden, um phylogenetische Bäume (Kreisbaum oder linearer Baum) zu erstellen, war der Kreisbaum (Abb. 3) bei der klaren Darstellung von Clustern und Subclustern besser als der lineare Baum.

Im Genotypisierungscluster 1 (Abb. 3) hatten die 25 PA-ARV-Feldstämme eine hohe Sequenzidentität (71,0–100 %) und wurden in drei verschiedene Subcluster unterteilt: Subcluster 1 wurde aus 16 PA-Broilerstämmen gebildet, die sich teilten 98,4–100 % AA-Identität. Subcluster 2 wurde aus 5 Broilerstämmen und 3 Legehennenstämmen gebildet, die eine AA-Identität von 80,6–97,6 % aufwiesen. Alle 11 ARV-Referenzstämme, einschließlich der von GenBank abgerufenen Standardimpfstoffstämme und des verbleibenden 1 PA-Broilerstamms, bildeten Subcluster 3. Die 24 PA-ARV-Feldstämme in Subcluster 1 und 2 hatten nur 70,6–88,8 % AA-Identität mit ARV-Referenzstämme und 72,1–75,4 % AA-Identität mit dem 1 PA ARV-Broilerstamm in Subcluster 3.

Im Genotypisierungscluster 2 teilten die 38 PA-ARV-Feldstämme einen weiten Bereich (58,8–100 %) der AA-Sequenzidentität und bildeten drei verschiedene Untercluster. Subcluster 1 bestand aus wenigen Hühnerstämmen, umfasste jedoch 15 Truthahnstämme, 2 Chukar-Rebhuhnstämme, 2 Broilerstämme und 1 Perlhuhnstamm und sie hatten eine 90,8–100 %ige AA-Identität. Subcluster 2 bestand aus 11 Broilerstämmen und 1 Perlhuhnstamm und sie hatten eine gemeinsame AA-Identität von 78,6–99,1 %. Subcluster 3 umfasste 5 Broilerstämme, 1 Legehennenstamm und 3 Referenzstämme und sie hatten eine gemeinsame AA-Identität von 66,0–100 %.

Im Genotypisierungscluster 3 hatten 4 der 5 Broilerstämme (außer Reo/Broiler/PA/28439/11) und 2 Legehennenstämme nur 77,8–80,5 % AA-Identität mit den 4 GenBank-Referenzstämmen. In Cluster 4 stammten alle 7 PA-ARV-Feldstämme von Broilern und 6 der 7 hatten eine hohe (93,1–99,1 %) aa-Identität; der verbleibende Stamm (Reo/PA/Broiler/05682/12) wies eine hohe Ähnlichkeit zum AVS-B-Stamm auf. Cluster 5 bestand aus 27 PA-ARV-Feldstämmen, darunter 23 Broilerstämme, 2 Legehennenstämme, 1 Truthahnstamm und 1 Ringhalsfasanstamm, mit hoher AA-Sequenzidentität zueinander (85,2–100 %) und einer mäßigen Verwandtschaft zueinander die 5 Referenzstämme (59,8–80,8 %) in diesem Cluster.

In dieser Studie wurde erstmals ein neuer Genotypisierungscluster, Cluster 6, identifiziert. Die 10 neuartigen PA-ARV-Feldstämme, darunter 9 Broilerstämme und 1 Truthahnstamm, bildeten den neuen Genotypisierungscluster 6, der sich von den Clustern 1 bis 5 unterschied. Die gemeinsame AA-Identität betrug 71,0–99,9 % innerhalb von Cluster 6, jedoch 42,6–60,1 %. innerhalb der anderen 5 Cluster.

Die σC-Gensequenzen von 114 ARV-Feldstämmen, die durch σC-Genotypisierungscluster gekennzeichnet sind und die in PA-Geflügel in den USA nachgewiesenen Genotypen 1 bis 6 repräsentieren, wurden im Oktober (5 von KM #s) 2014 und im Januar (51 von KP #s) in der GenBank hinterlegt. s) und Mai (58 der KR #s) 2015 (Tabelle 1).

Sehnen und Synovialgewebe waren die bevorzugten Proben für die ARV-Isolierung von Vögeln, die klinische Anzeichen und Läsionen zeigten, die denen einer ARV-Infektion entsprachen1,2,35. In einigen Fällen wurden auch andere Gewebe, einschließlich Herz, Leber und Darm, entnommen, wenn Perikarditis-Läsionen beobachtet wurden oder wenn klinische Anzeichen von schlechtem Wachstum, Malabsorption oder Maldigestion vorlagen. Die Autopsie und die Probenentnahme wurden in der Autopsieeinrichtung des Animal Diagnostic Laboratory der Pennsylvania State University gemäß den vom US-Landwirtschaftsministerium (USDA) genehmigten Richtlinien durchgeführt. (http://www.aphis.usda.gov/animal_health/lab_info_services/downloads/NecropsyGuideline.pdf).

Jede entnommene Gewebeprobe wurde mit einer sterilen Schere in einem sterilen 20-ml-Kunststoffbehälter (Kat.-Nr. 14310-684, www.vwr.com) zerkleinert und mit viralem Transportmedium in einer Verdünnung von 1:5 (w/v) verdünnt. Die Mischung wurde dann in einen Stomacher-Beutel gegeben und in einem Stomacher-Mixer (Modell 80, Seward, Ltd., UK) 2–3 Minuten lang homogenisiert. Anschließend wurde das Gewebehomogenisat in ein steriles konisches 15-ml-Polypropylenröhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 5 °C und 1200 U/min zentrifugiert. Schließlich wurde der Überstand gesammelt und durch einen 0,45-nm-Spritzenfilter filtriert, um für die Zellinokulation zur ARV-Isolierung bereit zu sein.

LMH (ATCC CRL-2113) ist eine primäre hepatozelluläre Karzinom-Epithelzelllinie, die aus der chemischen Umwandlung von Tumorknötchen in der Leber eines männlichen Leghornhuhns durch Langzeitbehandlung mit Diethylnitrosamin entwickelt wurde36. Die LMH-Zelllinie weist einen epithelialen Phänotyp und eine dendritische Morphologie auf. LMH-Zellen reagieren hochempfindlich auf ARV, Geflügel-Adenovirus, Birnavirus, Rotavirus, Pockenvirus und andere Vogelviren, die in unseren laufenden Forschungsstudien getestet wurden. LMH-Zellen werden routinemäßig in unserem Labor für Vogelvirologie kultiviert, um Vogelviren zur Diagnose von Infektionen zu isolieren.

Eine Zubereitung des LMH-Zellwachstumsmediums besteht aus 500 ml DMEM/F-12 50/50 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix, 1X) mit L-Glutamin und 15 mM HEPES (Corning Cellgro, Ref Nr. 10-092-CV, USA), 50 ml fötales Rinderserum (FBS), 5 ml PSA (Pen-Step-Amp) (Cellgro, Ref. Nr. 30-004-CI) und 2,5 ml Gentamicinsulfat (10 mg/ml). Die Zusammensetzung des LMH-Zellerhaltungsmediums ist die gleiche wie die des Wachstumsmediums, außer dass es nur 2 % (oder 10 ml) FBS enthält. Die LMH-Zellkulturverfahren sind kurz gesagt wie folgt: (1) Ein Fläschchen mit LMH-Stammzellen (1 ml pro T-25-cm2-Kolben, mindestens 1 × 106/lebensfähige Zellen) wurde aus einem Tank mit flüssigem Stickstoff entnommen und platziert in einem 37 °C warmen Wasserbad zum schnellen Auftauen und dann 10 Minuten lang bei 4 °C und 1000 U/min zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen. Alternativ wurde eine Flasche mit laufender LMH-Zellkultur zur Subkultivierung in einem Verhältnis von 1:4–1:6 gemäß routinemäßigem Zellkulturverfahren verarbeitet37; (2) Das Zellpellet wurde mit 1 ml vorgewärmtem Wachstumsmedium resuspendiert und im Verhältnis 1:20 (dh 1 ml Zellsuspension, 19 ml Wachstumsmedium) für die LMH-Zellsubkulturen verdünnt; (3) Die Zellsuspension hing von den Flaschen ab (z. B. 2,5 ml pro T-12,5-cm2-Flasche, 5 ml pro T-25-cm2-Flasche, 1,5–2 ml pro Vertiefung auf einer Zellkulturplatte mit 6 Vertiefungen oder 1 ml). pro Vertiefung auf einer Platte mit 12 Vertiefungen, die routinemäßig für den diagnostischen Zweck der Isolierung von Vogelviren in unserem Labor verwendet wurden); (4) Die mit LMH-Zellen besiedelten Flaschen wurden in einen Inkubator gestellt, der auf 37 °C und 5 % CO2 eingestellt war. Abhängig von der Aussaatdichte der Zellen bildete sich innerhalb von 48–72 Stunden eine konfluente Monoschicht. Wenn sich eine Monoschicht mit einer Konfluenz von 75 % oder mehr gebildet hatte, konnten die LMH-Zellflaschen zur Probeninokulation zur Isolierung von Vogelviren verwendet werden. Nicht inokulierte LMH-Zellflaschen dienten als fortlaufende Zelllinien-Subkulturen für bis zu 50 oder 100 Passagen. Ein Saatzellkolben konnte 1–2 Wochen lang aufbewahrt werden und das Subkulturverhältnis betrug 1:4–1:8, wie bei Standardverfahren für Zellsubkulturen37.

T12,5-cm2-Flaschen und 12- oder 24-Well-Platten mit einschichtigen LMH-Zellkulturen wurden in unserem Labor hauptsächlich für die Isolierung von ARV oder anderen Vogelviren verwendet. Das LMH-Wachstumsmedium wurde aus den Zellkulturflaschen entfernt und diese anschließend mit sterilem PBS (8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g NaH2PO4, 0,2 g KH2PO4, 1000 ml d-H2O) gespült, um restliches FBS aus den Zellen zu entfernen. Die Kolben wurden mit 0,25 ml (für T12,5-Flaschen) oder 0,5 ml (für T25-Flaschen) Überstand aus jeder Probenvorbereitung beimpft. Ein Zellkolben mit negativer Kontrolle wurde mit VTM beimpft. Die beimpften Zellflaschen wurden zur Adsorption des Inokulums 20–30 Minuten lang in einem Inkubator bei 37 °C inkubiert. Den Kolben wurde LMH-Erhaltungsmedium (2,5–3,0 ml für einen T12,5-Kolben, 2,0 ml/pro Well für eine 12-Well-Platte, 1 ml/pro Well für eine 24-Well-Platte) zugesetzt und bei 37 °C inkubiert unter 5 % CO2. Die mit Proben inokulierten Monolayer wurden täglich über einen Zeitraum von 5–7 Tagen auf die Entwicklung viraler zytopathischer Effekte (CPEs) untersucht. Für jede Probe wurden routinemäßig zwei bis drei Zellpassagen durchgeführt, um negative Ergebnisse zu bestätigen. Positive CPEs durch ARV oder andere häufige aviäre enterische Virusinfektionen (z. B. Adenovirus, Rotavirus, Herpesvirus und Birnavirus) wurden im Allgemeinen innerhalb von 1 bis 3 Zellpassagen festgestellt.

Von uns entwickelte neue Verfahren, die die FA-Färbung früher CPE-Zellen umfassen, wurden in dieser Studie routinemäßig zur ARV-Früherkennung eingesetzt. Kurz gesagt umfassten diese Verfahren die folgenden Schritte: (1) Eine Probe von 1 ml Zellkulturflüssigkeit, die virale CPE-Zellen enthielt (ohne Beendigung der Zellkulturen), wurde aus einem mit Proben beimpften Zellkulturkolben entnommen, als beobachtet wurde, dass die Zellen einem CPE unterzogen wurden und aus der Monoschicht in das Medium freigesetzt werden; (2) Die Zellkulturflüssigkeitsprobe wurde bei 900 U/min zentrifugiert, um die CPE-Zellen herunterzuschleudern; (3) Der Mediumüberstand wurde zurück in den ursprünglichen Kolben überführt (der weiterhin kultiviert wurde) und die CPE-Zellen wurden in PBS in einem Verhältnis von etwa 1:5 resuspendiert; (4) Die resuspendierten CPE-Zellen wurden auf einen 25 × 75 × 1 mm großen Mikroskopobjektträger (Globe Scientific, Inc., New Jersey, USA) mit 0,1–0,2 ml PBS (oder 1–2 Tropfen) pro Probe gegeben und eine runde Form mit 10–12 mm Durchmesser zum Lufttrocknen; (5) Der Objektträger wurde 10 Minuten lang mit kaltem (–20 °C) Aceton fixiert und der Probenbereich wurde mit einem Tintenstift oder einem Diamantstift umkreist; (6) Die CPE-Zellen wurden mit einem fluoreszierend markierten Anti-ARV-Antikörper (ID-Nr. 680 VDL 9501, NVSL, Ames, IA, USA) gefärbt und der Objektträger wurde 30–30 Minuten in einer Feuchtigkeitskammer in einem Inkubator bei 37 °C platziert. 40 Min. im Dunkeln; (7) Der fluoreszierende Antikörper wurde durch sanftes Spülen von einem Ende des Objektträgers (wodurch die Zellen nicht entfernt wurden) mit PBS entfernt und der Objektträger wurde dann für jeweils 2–3 Minuten mit PBS für insgesamt 3 Waschgänge geflutet; Dann wurde der Objektträger mit der Seite nach oben auf ein Papiertuch gelegt, um ihn an der Luft trocknen zu lassen (oder der Objektträger wurde in einen Objektträgerhalter gelegt und in ein Glasobjektträgergefäß mit einem Rührstab am Boden gegeben; das Glasgefäß wurde mit PBS gefüllt, bis Die Objektträger wurden abgedeckt und das Objektträgergefäß 8–10 Minuten lang auf eine Rührplatte gestellt, die auf eine sanfte Rührgeschwindigkeit eingestellt war, um den Waschvorgang abzuschließen. (8) Der Objektträger wurde mit Eindeckmedium (50 % PBS-Puffer, 50 % Glycerin, pH 8,4) eingedeckt und der gefärbte Bereich zur anschließenden Untersuchung unter ein Deckglas gelegt. Der Objektträger wurde bei Raumtemperatur aufbewahrt, wenn die Betrachtung innerhalb von 1 oder 2 Stunden erfolgen sollte, andernfalls wurde er im Kühlschrank aufbewahrt, damit er innerhalb von 24 Stunden betrachtet werden konnte. CPE-Zellen, die positiv für ARV waren, waren apfelgrün gefärbt.

Herkömmliche Verfahren zur Virusisolierung in Zellkulturen erfordern eine erhebliche Menge an CPE-Entwicklung (> 50–70 %) und die Beendigung der Zellkultur, um anschließende Virusidentifizierungstests durchzuführen und ein positives Isolat zu bestätigen. Durch den Einsatz unserer neuen Verfahren, insbesondere zur ARV-Isolierung in diesem Projekt, konnte bei den meisten ARV-positiven Fällen eine frühe Virusisolierung erreicht werden. Da für die ARV-positive Bestätigung durch FA-Färbung nur eine geringe Anzahl früher CPE-Zellen (nur 5–10) erforderlich war, wurden unsere Virusisolationsergebnisse für die ARV-Diagnose (im Durchschnitt) 2–3 Tage früher als zum Zeitpunkt von erstellt Entwicklung von über 50–70 % CPEs für den Abschluss der Zellkulturplatten.

Virale RNA wurde aus dem Zellkulturüberstand mit einem RNeasy Mini Kit (Kat.-Nr. 74106, QIAGEN, Valencia, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die extrahierte RNA wurde als Matrize zur Amplifikation eines 1088-bp-Fragments aus einem ARV-S1-Segment unter Verwendung der veröffentlichten Primer P1/P434 verwendet. Der RT-PCR-Assay wurde in einer 50-μl-Reaktionsmischung unter Verwendung eines One Step RT-PCR-Kits (Kat.-Nr. 210212, QIAGEN, Valencia, CA) durchgeführt, das 10 μl Template-RNA, 25 μl RNase-freies Wasser, 10 enthielt μl 5 × Puffer, 2 μl dNTP-Mix (je 10 mM dNTP), 1 μl Enzymmix und 1 μl von jedem der beiden Primer. Die Amplifikation wurde mit dem Thermocycler Applied Biosystems 9700 unter Verwendung eines Reverse-Transkriptionsschritts bei 50 °C für 30 Minuten durchgeführt. Der anfängliche PCR-Aktivierungsschritt wurde 15 Minuten lang auf 95 °C eingestellt; dann folgten 30 s lang 94 °C, 30 s lang 50 °C und 90 s lang 72 °C jedes Zyklus für 38 Zyklen; und wurde schließlich mit einem einzigen Zyklus von 72 °C für 5 Minuten abgeschlossen.

Die ARV S1-Segment-RT-PCR-Produkte wurden isoliert und in einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel sichtbar gemacht. Die spezifischen 1088-bp-Banden wurden herausgeschnitten und mithilfe eines einfachen Bindungs-/Wasch-/Elutionsverfahrens auf die Spin-Säulen eines Gelextraktionskits (Chargennr. 04113KE1, Axygen, Tewksbury, MA) geladen. Das gereinigte PCR-Produkt wurde mit einem NanoDrop™1000-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA) gemessen und auf 40 ng/μl verdünnt, um als Sequenzierungsvorlagen verwendet zu werden. Alle Proben und P1/P4-Primer (1 μM) wurden zur Sanger-Sequenzierung unter Verwendung des 3730XL DNA-Analysators (Applied Biosystems, Grand Island, NY) an die Penn State Genomics Core Facility übermittelt.

In dieser Studie verwendeten wir Neighbor-Joining-Methoden für die phylogenetische Analyse. Die Lasergene 12 Core Suite (DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA) wurde für die Zusammenstellung von Sanger-Sequenzierungsdaten, die ORF-Vorhersage und die Übersetzung von Nukleotidsequenzen verwendet. BLASTN-Suchen wurden eingesetzt, um die Sequenzähnlichkeiten zwischen den ARV-Feldstämmen und Referenzstämmen in der GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) zu untersuchen. Eine phylogenetische Analyse wurde am S1-Segment (Nukleotide 525–1424) des σC-Gens (900 Basen) durchgeführt. Die Sequenz-Alignments wurden mit dem Programm ClustalW 1.83 (http://align.genome.jp) durchgeführt. Es wurden Neighbor-Joining- und Maximum-Likelihood-Bäume (ML) generiert und Baumtopologien durch Bootstrap-Analyse validiert, wie sie im MEGA-Programm (Version 5.0) implementiert ist, mit absoluten Abständen nach 1000 Bootstrap-Replikaten38.

Die Methoden der klinischen und Autopsiediagnose wurden gemäß den vom US-Landwirtschaftsministerium (USDA) genehmigten Richtlinien durchgeführt. (http://www.aphis.usda.gov/animal_health/lab_info_services/downloads/NecropsyGuideline.pdf). Alle Versuchsprotokolle wurden von der Pennsylvania State University, dem Office for Research Protections, genehmigt.

Obwohl die Virusisolierung zeitaufwändig ist, wird sie in der diagnostischen Virologie immer bevorzugt und ist von entscheidender Bedeutung für die Entdeckung neuer Viren oder neu auftretender Feldstämme oder -varianten. In dieser Studie wurden unsere neu modifizierten Verfahren zur Früherkennung von Viren in Zellkulturen effektiv zur Früherkennung von ARV-Fällen eingesetzt. Sobald eine kleine Anzahl von CPE-Zellen in mit Proben beimpften Zellkulturen beobachtet wurde, wurde eine Probe der CPE-Zellen für die ARV-FA-Färbung entnommen, um die Ergebnisse der Virusisolierung zu bestätigen, ohne die Zellkulturen zu beenden. Dies ermöglichte eine frühere Diagnose als herkömmliche Verfahren zur Virusisolierung, bei denen gewartet werden muss, bis sich eine CPE-Entwicklung von 50–70 % entwickelt hat. Im Durchschnitt wurde das Virus bei den meisten ARV-Fällen durch das neue Verfahren 2–3 Tage früher isoliert. Darüber hinaus liefert das neue Verfahren durch die Verwendung konzentrierter CPE-Zellen eindeutige Ergebnisse und ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis weiterer verdächtiger Viren durch die Anfertigung von Duplikatobjektträgern.

σC ist das variabelste Protein in ARV39. Es vermittelt die Virusanheftung an Zielzellen und für σC spezifische Antikörper neutralisieren ARV-Infektionen40,41. In dieser Studie zeigten unsere Forschungsergebnisse aus der phylogenetischen Analyse von σC-Gensequenzen, dass die 114 ARV-Feldstämme genetisch unterschiedlich waren und in 6 Genotypisierungscluster oder Genotypen gruppiert waren (Abb. 3); 90 der 114 Isolate in den Clustern 2–6 waren Feldvarianten und unterschieden sich von den Standard-ARV-Impfstoffstämmen (S1133, 1733, 2408), die in Cluster 1 gruppiert sind. Noch wichtiger war ein neuartiger Genotypisierungscluster (Cluster 6). wurde in dieser Studie erstmals identifiziert. Die 10 neuartigen ARV-Feldstämme, die bei PA-Geflügel nachgewiesen wurden (9 von Masthühnern, 1 von Puten), bildeten den neuartigen ARV-Genotypisierungscluster 6 und die Stämme wiesen eine hohe genetische Diversität auf (bis zu 30 % Unterschied voneinander).

Innerhalb des Genotypisierungsclusters 1 bildeten 24 der 25 PA-ARV-Feldstämme separate Subcluster, die Unterschiede zum ARV-Impfstoffstamm-Subcluster zeigten, und die geringe AA-Identität (70,6–88,8 %) zwischen diesen Subclustern weist darauf hin, dass die 24 PA ARV Feldstämme sind nicht identisch mit den Impfstämmen oder möglicherweise impfstoffbedingte Feldvarianten. In ähnlicher Weise wurden auch in den Genotypisierungsclustern 2, 3, 4 und 5 aa-Identitätsvariationen zwischen Subclustern beobachtet, in denen die Mehrheit der PA-ARV-Feldstämme ihre eigenen Subcluster bildete, wodurch sie sich von den anderswo entdeckten ARV-Referenzstämmen unterschieden ( Niederlande, Deutschland, USA und Taiwan) (Abb. 3; S Tabelle 2). Nichtsdestotrotz deuten der neuartige Genotypisierungscluster 6 und die neu auftretenden Feldstämme oder Varianten in den Clustern 1 bis 5 darauf hin, dass revolutionäre ARV-Mutationen oder Rekombinationen aufgetreten sind oder kontinuierlich auftreten, die möglicherweise weiterhin zusätzliche ARV-Feldvarianten oder neue Stämme hervorbringen.

Im Genotypisierungscluster 2 bestand der Subcluster 1 aus 15 Putenstämmen, 2 Chukar-Stämmen, 2 Broilerstämmen und 1 Perlhuhnstamm, die in PA nachgewiesen wurden. Diese PA-ARV-Feldstämme hatten eine Nukleotidhomologie zwischen 90,8 % und 100 % untereinander und zwischen 92,3 % und 99,8 % mit den 3 MN-Truthahn-ARV-Stämmen, die im Jahr 2011 auftraten33, was darauf hindeutet, dass diese PA-ARV-Stämme wahrscheinlich aus dem Mittleren Westen übertragen wurden Stämme, die aus der Türkei stammen.

Da jeder ARV-Stamm 10 Genomsegmente der Größenklassen 3 L (groß), 3 M (mittel) und 4 S (klein) enthält26, können vollständige Genomsequenzierungscharakterisierungen detailliertere Genominformationen für die interessierenden ARV-Feldstämme liefern. Mithilfe traditioneller Genomsequenzierungsverfahren42 führten wir eine vollständige genomische Charakterisierung des PA-Broiler-ARV-Feldstamms (Reo/PA/Broiler/05682/12)43 durch. Unsere Ergebnisse der Genomsequenzierung dieses Broiler-ARV zeigten, dass die größte Sequenzähnlichkeit mit dem klassischen AVS-B-Stamm im S1-Segment des σC-Gens beobachtet wurde. Der Broiler-ARV-Feldstamm war den M2- und M3-Segmenten des AVS-B-Stammes nur mäßig ähnlich und die geringste Sequenzähnlichkeit trat in der am weitesten 5' entfernten Sequenz des M2-Genomsegments auf.

Wir führen derzeit Charakterisierungsstudien zur vollständigen Genomsequenzierung der neu auftretenden ARV-Varianten und neuartigen Stämme durch, indem wir das Next Generation Sequencing (NGS) Illumina MiSeq-System44 verwenden, das es uns ermöglicht, die Positionen mutierter Gene in den vollständigen Sequenzen aller zehn Genomen zu bestimmen Segmente. Jüngste wissenschaftliche Entdeckungen, die sich aus der Anwendung von NGS-Technologien ergaben, unterstreichen den bemerkenswerten Wert der Verwendung massiv paralleler Plattformen für genetische Analysen45,46,47,48,49. Diese neuen Methoden haben zuvor fokussierte Auslesungen aus einer Vielzahl von DNA-Vorbereitungsprotokollen auf den genomweiten Maßstab ausgeweitet und die Auflösung dieser Auslesungen auf Einzelbasengenauigkeit verfeinert. Auch die Sequenzierung von RNA hat Fortschritte gemacht und umfasst nun cDNA-Analysen in voller Länge, serielle Analysen auf der Genexpression basierender Methoden und die Entdeckung nichtkodierender RNA. Daher wird die Anwendung von NGS-Methoden zur Fortsetzung dieser ARV-Forschung vollständige genomische Sequenzinformationen für die neu auftretenden ARV-Feldvarianten und neuartigen Stämme liefern und es uns ermöglichen, besser zu verstehen, wie diese neuartigen Stämme revolutionäre genomische Veränderungen erreicht haben.

Der wichtigste Kontrollansatz zur Begrenzung der mit ARV-Infektionen verbundenen klinischen Krankheit besteht darin, die Züchter angemessen mit wirksamen Impfstoffen zu impfen, wodurch das Potenzial für eine vertikale Übertragung verringert und die Nachkommen mit spezifischen mütterlichen Antikörpern versorgt werden, die vor den aktuellen Feldstämmen schützen. Zusätzlich zur in dieser Studie beschriebenen Sequenzierungscharakterisierung des σC-Gen-S1-Segments wird die vollständige Genomcharakterisierung der neu auftretenden ARV-Feldstämme detailliertere wissenschaftliche Daten liefern, die es uns ermöglichen, ARV-Mutationen, Rekombinationen und verwandte molekulare epidemiologische Merkmale besser zu verstehen. Diese Studien werden bei der Entwicklung wirksamer autogener Impfstoffe gegen abgetötete Viren und Lebendviren sowie anderer Schutzstrategien helfen.

Zitierweise für diesen Artikel: Lu, H. et al. Isolierung und molekulare Charakterisierung neu auftretender Vogel-Reovirus-Varianten und neuartiger Stämme in Pennsylvania, USA, 2011–2014. Wissenschaft. Rep. 5, 14727; doi: 10.1038/srep14727 (2015).

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Referenzen herunterladen

Diese Diagnose- und Forschungsstudien zum Vogel-Reovirus wurden vom Pennsylvania Department of Agriculture (PDA), dem Forschungsprogramm der Animal Health and Diagnostic Commission (AHDC), 2013–2015, Pennsylvania, USA, finanziert; Das Pennsylvania Poultry Industry Broiler/Egg Check-Off Research Program und das Pennsylvania Soybean Board Research Program, 2015, Pennsylvania, USA.

Tierdiagnostisches Labor, Abteilung für Veterinär- und Biomedizinwissenschaften, Pennsylvania State University, University Park, 16802, PA

Huaguang Lu, Yi Tang, Patricia A. Dunn, Eva A. Wallner-Pendleton, Lin Lin und Eric A. Knoll

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HL verfasste den Haupttext des Manuskripts, bereitete Tabellen (1, 2, S1, S2) und Abbildungen (1a, 1b und 2) vor, überwachte das Projekt und half bei Virusisolierungen und molekularen Studien. YT führte die molekularen Charakterisierungsstudien und die Sequenzierungsdatenanalyse durch, erstellte Abbildung 3 und unterstützte die Tabellen 1, 2 und S2. PAD und EAW führten Felduntersuchungen, klinische und pathologische Diagnosen sowie Probenentnahmen durch und erstellten Abbildung 1(c–f). LL führte LMH-Zellkulturen, Virusisolierungen und FA-Tests sowie unterstützte molekulare Tests durch, Tabelle S1 und Abbildung 2. EAK führte die Probenverarbeitung durch und unterstützte die Virusisolierung und Tabelle S1. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Klinische Anzeichen und pathologische Läsionen von Vogel-Reovirus-Infektionen bei Masthühnern.

(a) Broilerfälle mit schwerer Sehnenscheidenentzündung im Alter von 4 Wochen; (b) Tenosynovitis im Zusammenhang mit dem gesamten Bein; (c) Schwellungen, Ödeme und Blutungen in den Sehnen und Sehnenscheiden; (d) Sehnenruptur in voller Dicke; (e) Perikarditis-Läsionen; (f) Mikroskopische Läsionen einer chronischen lymphozytären plasmazytären Tenosynovitis im Querschnitt von Sehne, Synovia und assoziiertem Gewebe in der Nähe des Intertarsalgelenks.

Nachweis des Aviären Reovirus (ARV) durch Fluoreszenzantikörpertest (FA) an Reovirus-infizierten Zellen mit zytopathischem Effekt (CPE).

(1a) Negativkontrolle normaler LMH-Zellkulturen; (2a), (3a) und (4a) Riesige oder „blütenartige“ CPE-Zellen, die für ARV-Infektionen in LMH-Zellkulturen charakteristisch sind; (1b) FA-Test negativ bei normalen LMH-Zellen; (2b), (3b) und (4b) FA-Testpositiv auf ARV-infizierten CPE-Zellen. Hinweis: Die FA-gefärbten, nicht infizierten LMH-Zellblätter (1b) und ARV-infizierten Zellblätter (2b, 3b, 4b) wurden aus den entsprechenden LMH-Zellkulturen (1a, 2a, 3a, 4a) in etwa 1 ml Kulturmedium geerntet Anschließend werden sie auf Objektträgern für den FA-Test vorbereitet.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lu, H., Tang, Y., Dunn, P. et al. Isolierung und molekulare Charakterisierung neu auftretender Vogel-Reovirus-Varianten und neuartiger Stämme in Pennsylvania, USA, 2011–2014. Sci Rep 5, 14727 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14727

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Eingegangen: 2. April 2015

Angenommen: 7. September 2015

Veröffentlicht: 15. Oktober 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep14727

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