Identifizierung nichtinvasiver diagnostischer Biomarker für Eileiterschwangerschaften anhand von Daten

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 19992 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Derzeit hängt die Diagnose einer Eileiterschwangerschaft hauptsächlich von transvaginalem Ultraschall und β-hCG ab. Diese Methoden können jedoch die Diagnose und Behandlungszeit verzögern. Unser Ziel war es daher, nach serologischen molekularen Markern für die frühe Diagnose einer Eileiterschwangerschaft (EP) zu suchen. Mithilfe der datenunabhängigen Akquisitionsproteomik (DIA) wurden die Differenzproteine im Serum zwischen der intrauterinen Schwangerschaft (IP) und der EP-Gruppe ausgewählt. Anschließend wurden die Expressionsniveaus dieser Differenzproteine durch einen enzymgebundenen Immunosorbens-Assay gemessen. Der diagnostische Wert der Serumbiomarker wurde durch eine Receiver-Operating-Characteristic-Curve-Analyse bewertet. GSTO1, ECM-1 und β-hCG zeigten signifikante Unterschiede zwischen der EP- und der IP-Gruppe (P < 0,05). Die Kombination aus GSTO1/ECM-1/β-hCG hatte eine Fläche unter der Kurve von 0,93 (95 %-KI 0,88–0,99), eine Sensitivität von 88,89 % (95 %-KI 73,94–96,89) und eine Spezifität von 86,11 % (95). % KI 70,50–95,33) mit einem Wahrscheinlichkeitsverhältnis von 6,40. Die Kombination von GSTO1/ECM-1/β-hCG könnte zu einem möglichen Ansatz für die Frühdiagnose von EP entwickelt werden.

Eine Eileiterschwangerschaft (EP) ist definiert als eine Schwangerschaft, die außerhalb der Gebärmutter auftritt, am häufigsten im Eileiter, sie kann aber auch in einem Eierstock, der Bauchhöhle und einem Gebärmutterhorn auftreten1. Die Prävalenz einer Eileiterschwangerschaft wird auf 2 % aller Schwangerschaften geschätzt und ist eine erhebliche Todesursache bei schwangeren Frauen2. Derzeit macht es immer noch 6 % der schwangerschaftsassoziierten Morbiditäten aus3. Typische Symptome einer Eileiterschwangerschaft sind das Ausbleiben der Menstruation, plötzliche Bauchschmerzen und vaginale Blutungen4. In schweren Fällen kann es zu Synkopen, Schock und sogar zum Tod kommen4. Daher sind die Diagnose und frühzeitige Behandlung einer Eileiterschwangerschaft besonders wichtig. Derzeit hängt die Diagnose einer Eileiterschwangerschaft hauptsächlich vom transvaginalen Ultraschall und der quantitativen Messung der β-Untereinheit des menschlichen Choriongonadotropins (β-hCG)5 ab. In der Praxis geht eine Patientin jedoch erst nach Bauchschmerzen und Vaginalblutungen zum Arzt, wodurch sich die Diagnose und die Behandlungszeit leicht verzögern. Darüber hinaus müssen aktuelle Diagnosemethoden im Krankenhaus durchgeführt werden. Wir möchten eine Früherkennungsmethode für Eileiterschwangerschaften entwickeln, die zu Hause angewendet werden kann, um den Schaden einer Eileiterschwangerschaft erheblich zu reduzieren. Daher Frühwarnung und bessere Diagnose von Eileiterschwangerschaften sind dringende Probleme.

In den letzten 20 Jahren haben Forscher nach serologischen Markern für eine Eileiterschwangerschaft gesucht, aber aufgrund verschiedener Schwierigkeiten wurden bisher nur geringe Fortschritte erzielt. Derzeit ist β-hCG immer noch der am häufigsten verwendete Serummarker in der klinischen Praxis, ein einzelner β-hCG-Spiegel im Serum kann jedoch nur eine Schwangerschaft, nicht aber den Ort der Schwangerschaft widerspiegeln. Daher ist Serum-β-hCG nicht für die Diagnose einer Eileiterschwangerschaft geeignet.

Um eine Eileiterschwangerschaft besser diagnostizieren zu können, wurden mehrere Studien durchgeführt und mehrere Indikatoren identifiziert, wie Progesteron, VEGF, Inhibin A, Aktivin A oder eine Kombination aus Progesteron, β-hCG, CA125 und CD3 + T-Zell-Prozentsätzen6 . Im Jahr 2007 stellten Florio et al. berichteten erstmals, dass Activin A zur Vorhersage einer Eileiterschwangerschaft verwendet werden kann7. Wenn die Nachweisgrenze auf 0,37 ng/ml eingestellt wurde, betrugen die Sensitivität und Spezifität 100 % bzw. 99,6 %. Das Ergebnis konnte jedoch in nachfolgenden Bestätigungsstudien nicht bestätigt werden. Yan et al. berichteten, dass die Sensitivität und Spezifität von Adrenomedullin (ADM) bei der Erkennung einer Eileiterschwangerschaft nur 53,50 % bzw. 85,00 % betrug8. Allerdings sind diese Faktoren aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse oder geringer Sensitivität und Spezifität nur begrenzt praktikabel.

Data Independent Acquisition (DIA) ist eine neue quantitative Proteomiktechnik, die eine schnelle und empfindliche Proteinprofilierung aus komplexen Mischungen ermöglicht. Dieser Nachweis ermöglicht eine eindeutige Identifizierung und Quantifizierung aller Lipide (sowohl schwache als auch stark vorkommende Peaks). Durch die Verwendung neuartiger Scanfunktionen und Datenverarbeitungsabläufe stellt DIA einen Paradigmenwechsel in den Erwartungen dar, die mit der quantitativen Proteomikanalyse verbunden sind9. Das Ziel dieser Studie war das Screening nach serologischen molekularen Markern einer Eileiterschwangerschaft mithilfe der auf datenunabhängiger Erfassung (DIA) basierenden quantitativen Proteomik.

In dieser Studie rekrutierten wir 36 Frauen mit Eileiterschwangerschaft und 36 Frauen mit normaler Frühschwangerschaft als Kontrollen nach klinischer Bewertung, β-hCG und vaginaler Ultraschalluntersuchung. Demografische Informationen und klinische Merkmale sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Schwangerschaftsergebnisse umfassten 36 (50,0 %) lebensfähige IPs und 36 (50,0 %) EPs. Siebenundzwanzig EPs (75,0 %) wurden in Eileitern und neun (25,0 %) in Uterusschnitten platziert. Beide Gruppen von Frauen befanden sich in den frühen Stadien der Schwangerschaft und es wurde kein signifikanter Unterschied in Bezug auf Alter und Gestationsalter (P > 0,05) beobachtet, das durch den ersten Tag der letzten Menstruationsperiode bestimmt wurde. Darüber hinaus waren die β-hCG-Spiegel in allen Proben messbar und lagen in der EP-Gruppe signifikant (P < 0,001) niedriger als in der IP-Gruppe (Tabelle 1).

Potenzielle Biomarker in den Serumproben zur Bewertung der Aktivität wurden mithilfe der datenunabhängigen Erfassungsproteomik (DIA) gescreent. Wie in Abb. 1 dargestellt, weist jede der fünf ausgewerteten Proben mehrere positive Punkte auf. Die Intensitäten von TSP1, GSTO1, INHBC, CLEC3B und ECM-1 in den Serumproben der EP-Gruppe unterschieden sich signifikant von denen der IP-Gruppe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese serologischen Marker nützliche Ziele für die Diagnose von EP sein könnten.

Vulkandiagramm (A) und Cluster-Heatmap (B) der unterschiedlich exprimierten Proteine zwischen IP- und EP-Gruppe.

Die Expression von TSP1, GSTO1, INHBC, CLEC3B, ECM-1 und β-hCG im Serum wurde mittels ELISA gemessen (n = 36). Wie in Abb. 2 gezeigt, waren die Expressionsniveaus von GSTO1 bei Patientinnen mit EP signifikant höher als bei Patientinnen mit normaler Schwangerschaft (P = 0,01). Obwohl CLEC3B keinen Unterschied zwischen EP und IP zeigte, verringerte sich das Expressionsniveau von CLEC3B in TEP signifikant (P = 0,04). Interessanterweise waren die ECM-1-Konzentrationen in EP und TEP signifikant niedriger als die in IP (P < 0,001). Die β-hCG-Spiegel waren bei EP- und TEP-Schwangerschaften signifikant niedriger als bei normalen Schwangerschaften (P < 0,001). Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied bei TSP1, INHBC oder CLEC3B zwischen den drei Gruppen.

Konzentrationen von TSP1, GSTO1, INHBC, CLEC3B, ECM-1 und β-hCG im Serum von IP- und EP-Frauen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.

Eine Subgruppenanalyse nach Gestationsalter (< 50 vs. ≥ 51 Tage) zeigte, dass die GSTO1-Spiegel bei Patienten mit EP, deren Gestationsalter ≥ 51 Tage betrug, signifikant höher waren als bei Patienten mit IP, deren Gestationsalter ≥ 51 Tage (P = 0,01) und Patienten mit EP, deren Gestationsalter < 50 Tage beträgt (P = 0,02). Die ECM-1-Konzentrationen waren bei EP-Patienten mit einem Gestationsalter von < 50 Tagen signifikant niedriger als bei IP-Patienten (P = 0,01). Die gleichen niedrigeren ECM-1-Spiegel wurden auch bei EP-Patienten beobachtet, deren Gestationsalter ≥ 51 Tage betrug (P < 0,001). Darüber hinaus waren die β-hCG-Konzentrationen von EP-Patienten mit einem Gestationsalter von ≥ 51 Tagen niedriger als die von IP-Patienten mit einem Gestationsalter von ≥ 51 Tagen (P = 0,001) (Abb. 3).

Subgruppenanalyse der Konzentrationen von TSP1, GSTO1, INHBC, CLEC3B, ECM-1 und β-hCG im Serum von IP- und EP-Frauen nach Gestationsalter (< 50 vs. 51 Tage). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt.

Die ROC-Kurve wurde verwendet, um die Sensitivität/Spezifität, den positiven/negativen Vorhersagewert, das Wahrscheinlichkeitsverhältnis (LR) und die Fläche unter der Kurve (AUC) von GSTO1, INHBC, β-hCG und verschiedenen Kombinationen als diagnostische Tests zu bewerten. Tabelle 2 und Abb. 4 zeigen die signifikante Unterscheidungsfähigkeit erhöhter GSTO1-, ECM-1-, β-hCG- und verschiedener Kombinationswerte für die Diagnose von EP.

Empfängerbetriebskennlinien von GSTO1, ECM-1 und β-hCG.

Im Detail erreichte GSTO1 beim Cutoff von 4343 pg/ml eine Sensitivität von 63,89 % (95 %-Konfidenzintervall (KI), 46,22–79,18) und eine Spezifität von 69,44 % (95 %-KI, 51,89–83,65) als einzelnes Serum Marker für die EP-Vorhersage (AUC: 0,70 (95 %-KI: 0,58–0,82)) mit einem LR von 2,09. Wenn eine ECM-1-Konzentration von 4732 pg/ml als Grenzwert für die Diagnose von EP in der Kontrollgruppe verwendet wurde, betrug die Sensitivität 72,22 % (95 %-KI: 54,81–85,80), die Spezifität 75,00 % (95 %-KI). , 57,80–87,88) als einzelner Serummarker für die EP-Vorhersage (AUC: 0,82 (95 %-KI, 0,72–0,91)), und der LR betrug 2,89. β-hCG erreichte beim Grenzwert von 24.300 mIU/ml eine Sensitivität von 80,56 % (95 %-KI: 63,98–91,81) und eine Spezifität von 77,78 % (95 %-KI: 60,85–89,88). Die AUC für β-hCG betrug 0,83 (95 %-KI: 0,74–0,93), mit einer LR von 3,63. Durch die Kombination aller Faktoren haben wir die Formel y = (0,0003*GSTO1)-(0,001*ECM1)-(0,00003*hCG) + 3,518 erstellt. Der kombinierte Nachweis dieser drei serologischen Marker hatte eine AUC von 0,93 (95 %-KI: 0,88–0,99), eine Sensitivität von 88,89 % (95 %-KI: 73,94–96,89) und eine Spezifität von 86,11 % (95 %-KI: 70,50–). 95,33) mit einem LR von 6,40.

Angesichts der Tatsache, dass die Diagnose einer Eileiterschwangerschaft im frühen Schwangerschaftsalter eine klinische Herausforderung darstellt, ist die Erforschung eines Biomarkers zur Vereinfachung und Verbesserung der Diagnose einer Eileiterschwangerschaft ein Forschungsschwerpunkt. Einige Studien haben gezeigt, dass es keinen einzigen diagnostischen Biomarker für eine Eileiterschwangerschaft gibt, der dies kann wurde ausreichend getestet und liefert zufriedenstellende Ergebnisse10. Die Verwendung mehrerer Serummarkeranalysen könnte eine mögliche Lösung für die Diagnose von EP sein. In dieser Studie haben wir herausgefunden, dass GSTO1, ECM-1 und β-hCG serologische Marker für die Frühdiagnose von EP sein können, insbesondere wenn die drei Faktoren miteinander kombiniert werden und die beste Sensitivität und Spezifität aufweisen.

Jeder Marker, den wir wählen, ist biologisch plausibel. Glutathiontransferase (GST) ist eine große Familie von Transferasen, die mit dem Fortschreiten von Tumoren und dem Metabolismus von Fremdkörpern (z. B. Umweltschadstoffen) zusammenhängt11. Es wurde bestätigt, dass Omega-GST 1 in einer Vielzahl von Geweben weit verbreitet ist und über die Aktivität verschiedener biologischer Enzyme verfügt, insbesondere derjenigen, die an der Biotransformation von Arsen beteiligt sind12,13,14. Einige Studien haben herausgefunden, dass es einen statistischen Zusammenhang zwischen wiederkehrenden Aborten und der GSTO1-Mutation während der Schwangerschaft gibt. Sie spekulierten weiter, dass dieser Zusammenhang mit der durch die GSTO1-Mutation verursachten Veränderung der Ascorbatreduktase-Aktivität und des Arsenstoffwechsels zusammenhängt15. In einer Studie zum Zusammenhang zwischen Schwangerschaft und GSTO1 wurde auch festgestellt, dass GSTO1 mit einer fetalen intrauterinen Wachstumsbeschränkung zusammenhängt16,17. In dieser Studie stellten wir fest, dass sich die GSTO1-Spiegel in der IP- und EP-Gruppe über mehr als 51 Tage der Schwangerschaft deutlich unterschieden, die Sensitivität und Spezifität des Unterschieds jedoch nicht hoch waren.

Extrazelluläres Matrixprotein 1 (ECM-1) ist ein Glykoprotein, das normalerweise als funktionelles Bindungskernprotein fungiert und mit einer Vielzahl von Proteinen interagiert, um Angiogenese und Tumorwachstum zu regulieren18. Beispielsweise ist die Interaktion von ECM-1 mit Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP9), dem epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), CX3CL1 und CCL14 am Auftreten und der Entwicklung vieler Krankheiten beteiligt19,20,21. Graubner et al. schlugen vor, dass im Endometriumepithel im Frühstadium der Schwangerschaft eine große Menge an ECM1 beobachtet werden kann, was möglicherweise mit der Dezidualisierung und der Implantationsvorbereitung zusammenhängt22. Mit fortschreitender Schwangerschaft ändert sich die Menge an ECM-1 entsprechend, was darauf hindeutet, dass ECM-1 eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Schwangerschaft und der Entwicklung des Fötus spielt23,24. Hannan et al. fanden heraus, dass CX3CL1 und CCL14 die Trophoblastenmigration in der Frühschwangerschaft fördern, indem sie ECM-120 regulieren. Daher haben wir die Beziehung zwischen ECM-1 und EP untersucht und einen signifikanten Unterschied zwischen der IP-Gruppe und der EP-Gruppe festgestellt, was auf die Möglichkeit von ECM-1 bei der Diagnose von EP im Frühstadium schließen lässt.

Andere Marker für die Entwicklung einer Schwangerschaft waren weniger signifikant. Thrombospondin-1 (TSP-1) ist ein empfindlicher Index für die Überwachung der Thrombozytenaktivierung in vitro25. Studien haben gezeigt, dass die Expression von TSP-1 in gewissem Zusammenhang mit der Schwangerschaft steht und das Expressionsniveau in verschiedenen Muskelgeweben in verschiedenen Schwangerschaftsstadien unterschiedlich ist, was die normale Bildung von Blutgefäßen während der Schwangerschaft gewährleistet und die Stabilität der Blutgefäße aufrechterhält Bett26,27. Inhibin Beta C (INHBC) gehört zur Familie der transformierenden Wachstumsfaktoren Beta (TGF-β), kommt weit verbreitet in der Plazenta und im Endometrium vor und hat eine zellproliferationshemmende Wirkung28,29,30. Abdoli et al. und Fortes et al. wiesen darauf hin, dass das INHBC-Gen an der Vererbung von Fortpflanzungsmerkmalen von Schafen und Rindern beteiligt ist31,32, und einige Wissenschaftler wiesen auch darauf hin, dass INHBC am Prozess der Blastozystenimplantation beteiligt ist33. Mitglied B der C-Typ-Lektindomänenfamilie 3 (CLEC3B) ist ein Bindungsprotein, das eine spezifische Bindungswirkung auf Plasminogen Kringle-434 hat. Rocha et al. schlugen vor, dass der Fötus die CLEC3B-Sekretion während der Schwangerschaft stimulieren kann, sodass CLEC3B eine Rolle bei der Diagnose einer frühen Schwangerschaft spielt35. Leider haben wir in dieser Studie keinen signifikanten Unterschied bei diesen drei Markern zwischen der IP-Gruppe und der EP-Gruppe festgestellt, es sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich.

Als am häufigsten verwendeter serologischer Indikator für EP spielt β-hCG eine sehr wichtige Rolle bei der Diagnose einer frühen Eileiterschwangerschaft. Oft lässt ein niedriger β-hCG-Spiegel die Möglichkeit einer EP vermuten, aber β-hCG allein bestätigt oder schließt EP nicht aus, was mit unseren experimentellen Ergebnissen übereinstimmt36,37,38. Obwohl es signifikante Unterschiede zwischen der IP-Gruppe und der EP-Gruppe gab, waren die Sensitivität und Spezifität von β-hCG für die Diagnose von EP gering und GSTO-1 und ECM-1 zeigten die gleichen Ergebnisse. Wenn jedoch β-hCG, GSTO-1 und ECM-1 kombiniert wurden, waren sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität deutlich erhöht, was auf die Möglichkeit einer frühzeitigen Diagnose von EP schließen lässt.

Aufgrund des begrenzten Erfolgs einzelner Serum-Biomarker-Messungen haben mehrere Forscher damit begonnen, die Möglichkeit der Verwendung mehrerer Marker-Analysen zur Diagnose einer Eileiterschwangerschaft in der Eileiter zu untersuchen.O'Leary et al. untersuchten die Progesteron- und β-hCG-Spiegel und fanden in vorläufigen Studien heraus, dass ein Plasma-β-hCG < 3000 IU/l und ein Plasma-Progesteron < 40 nmol/l eine Eileiterschwangerschaft mit einer Sensitivität von 88 % und einer Spezifität von 82 vorhersagen konnten %39. In einer retrospektiven Studie wurden 289 Frauen in der Notaufnahme analysiert, bei denen EP, Spontanabort oder eine lebensfähige intrauterine Schwangerschaft diagnostiziert wurden. Die Forscher sammelten die Serumkonzentrationen von Progesteron, hCG und Aktivin A dieser Patientinnen und führten eine statistische Analyse durch40. Ihre Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Grenzwerte für Progesteron (< 10 ng/ml), hCG (< 6.699 IE/l) und Aktivin A (< 0,26 ng/ml) durch ROC-Analyse optimiert wurden und dass das Multimarker-Panel, das alle drei Biomarker nutzt, dies auch getan hat eine Sensitivität von 70 % und eine Spezifität von 69 %40. Unsere Studie bestätigt auch diese Erkenntnisse, dass die Kombination mehrerer Marker in einem einzigen Test eine bessere Diagnostik bietet als einzelne Proteine. Darüber hinaus waren die Ergebnisse unserer Studie denen der oben genannten Studien hinsichtlich Sensitivität und Spezifität ähnlich.

Bei diesem Experiment gibt es Einschränkungen. Erstens gelten diese Ergebnisse als vorläufig und viele der Analysen werden in der klinischen Praxis nicht routinemäßig verwendet. Die externe Validierung zukünftiger Pläne wird in einem separaten Stichprobensatz durchgeführt. Zweitens ist unsere Stichprobengröße relativ klein, was zu Abweichungen in den Ergebnissen führen kann. Es wird empfohlen, in künftigen Untersuchungen eine größere Stichprobe zu verwenden. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse verschiedener Proteine in der IP-Gruppe und der EP-Gruppe kaum Unterschiede, was möglicherweise nicht auf den klinischen Schnelluntersuchungsindex übertragen werden kann.

Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass GSTO1/ECM-1/β-hCG im Serum potenziell nützliche Biomarker für die Frühdiagnose von EP sein könnten, was in Studien mit größeren Stichprobengrößen bestätigt werden sollte. Wir hoffen, dieses Forschungsergebnis präsentieren zu können Inspiration für nachfolgende Forscher in Forschungsdesign und Forschungsideen liefern.

In der EP-Gruppe umfassten die Einschlusskriterien die 4. bis 12. Schwangerschaftswoche, Bauchschmerzen, Blutungen und andere klinische Symptome sowie die durch transvaginale Ultraschalluntersuchung bestätigte Diagnose von EP (einschließlich Eileiterschwangerschaft, Uterusschnittnarbenschwangerschaft und Uterushornschwangerschaft). Frauen mit einer Vorgeschichte von Wechseljahren und erhöhtem β-hCG im Serum, aber ohne durch Ultraschall bestätigte Diagnose oder ohne Besserung nach konservativer Behandlung wurden ausgeschlossen. In der Gruppe der intrauterinen Schwangerschaften (IP) umfassten die Einschlusskriterien die 4. bis 12. Schwangerschaftswoche, keine Bauchschmerzen, Blutungen oder andere klinische Symptome sowie eine durch Ultraschall bestätigte fetale Uterusknospe. Klinische Daten wurden für alle Patienten aufgezeichnet, einschließlich Alter, Gestationsalter, Serum-β-hCG-Konzentration, Progesteronkonzentration und klinische Diagnose. Diese Studie wurde von den Ethikkommissionen des West China Second Hospital der Sichuan University (Nr. 124) und genehmigt Alle Patienten unterzeichneten Einverständniserklärungen.

In Krankenhäusern der dritten Klasse A wurden jeweils 2 bis 3 ml einer periphervenösen Blutprobe von EP- und IP-Patienten entnommen. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei 4 °C und 1000 U/min zentrifugiert, und das Serum wurde abgetrennt, verpackt und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Alle Proben wurden von nicht verwandten Han-Individuen ausgewählt.

Zehn Serumproben (von 5 EP-Patienten und 5 IP-Patienten) wurden verwendet, um ein proteomisches Screening durch datenunabhängige Erfassung (DIA) durchzuführen. Alle ausgewählten Proben wurden hinsichtlich Alter und Gestationsalter abgeglichen (siehe ergänzende Tabelle 1).

Der erste Schritt ist die Probenentnahme und Qualitätskontrolle. Zunächst wurden 10 μl Serum von jeder Probe (enthaltend Trypsininhibitoren) bei Raumtemperatur (RT) zur Harzaufschlämmung in der Säule gegeben. Nach dem Mischen wurde die Säule auf den Rotator gestellt und eine Stunde lang rotiert. Zweitens wurde die Säule bei entferntem Boden und Deckel in ein 2-ml-EP-Röhrchen gegeben und 2 Minuten lang bei 4 °C und 1.000 g zentrifugiert. Drittens wurden die eluierten Proben nach der Entfernung der häufigsten 12 Proteine aus dem Plasma durch Vakuum-Gefriertrocknung aufbewahrt. Die lyophilisierte Probe wurde zur erneuten Auflösung zu 100 μl SDS gegeben und anschließend 10 Minuten bei RT bei 12.000 g zentrifugiert. Der Überstand war die Gesamtproteinlösung, deren Konzentration mit der Bicinchoninsäure (BCA)-Methode bestimmt wurde. Schließlich wurde jede Probe (8 µg) durch 12 % SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Danach wurden die getrennten Gele durch Coomassie-Brillantblau-Färbung gefärbt und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen, bis der Hintergrund klar war. Zur Qualitätskontrolle wurden die Gele mit ImageScanner gescannt, um zu beurteilen, ob anhand der Bilder Folgeexperimente möglich waren.

Die zweite Stufe ist das DIA-Experiment. Nach der Proteinquantifizierung wurde zunächst eine 30 μg-Probe in ein Ultrafiltrationsröhrchen gegeben und mit 120 μl Reduktionsmittelpuffer (10 mM DTT, 8 M Harnstoff, 100 mM TEAB; pH 8,0) 1 Stunde lang bei 60 °C umgesetzt. Nach der Reaktion wurde IAA zugegeben, bis die Endkonzentration 50 mM betrug, und die Reaktionszeit betrug 40 Minuten bei RT ohne Licht. Die Lösung am Boden des Sammelröhrchens wurde nach 20-minütiger Zentrifugation bei 12.000 U/min und 4 °C verworfen. Danach wurden 100 μl Puffer (300 mM TEAB) in das Röhrchen gegeben und zweimal 20 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Nach dem Austausch des Sammelröhrchens wurden 100 μl Puffer (300 mM TEAB) und 2 μl Trypsinlösung in Sequenzierungsqualität (1 μg/μl) in das Ultrafiltrationsröhrchen gegeben und 12 Stunden lang bei 37 °C umgesetzt. Die Peptide nach der Enzymolyse wurden nach 20-minütiger Zentrifugation bei 12.000 U/min gesammelt. Anschließend wurden 50 μl Puffer (200 mM TEAB) in das Röhrchen gegeben und 20 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Die Lösung am Boden des Röhrchens wurde gesammelt und lyophilisiert. Zweitens wurden die Peptide nach der Enzymolyse und Lyophilisierung mit 1 ml 0,1 % TFA erneut aufgelöst und mit einer RP-C18-Festphasenextraktionssäule (SPE) entsalzt. Drittens wurden für die LC-MS/MS-Analyse die IRT-Standardprobe und die zu testende Probe in einem Volumenverhältnis von 1:10 gemischt und eine massenspektrometrische Analyse durchgeführt.

Nach der Trennung der flüssigen Phase bei hohem pH-Wert und der Flüssigkeitsmassenspektrometrie wurden die enzymolysierten Peptide jeder Probe separat am Computer gesammelt und eine Spektralbibliothek mithilfe der Spectreonaut Pulsar X-Software zur Datenanalyse erstellt. Der t-Test wurde an den wiederholten Werten jeder Gruppe durchgeführt, um die Faltungsänderung und den P-Wert jeder Vergleichsgruppe zu berechnen, und dann wurde ein Zwei-Standard-Screening durchgeführt (Fachungsänderung = 1,2, P-Wert < 0,05). Proteine (Fachveränderung > 1,2 oder < 5/6, P-Wert < 0,05) wurden als signifikant unterschiedlich exprimierte Proteine angesehen, die aufgelistet und mit Farben markiert sind.

Die Verifizierung großer Proben der Proteine (Fachänderung > 1,2, P-Wert < 0,01) wurde durch einen Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) unter Verwendung kommerzieller Kits durchgeführt, die von RayBiotec, Inc. (Norcross, GA), R&D Systems (Minneapolis, MN) erworben wurden. , und Abbexa, Inc. (Peking, China). Die Experimente wurden nach den vom Hersteller empfohlenen Verfahren durchgeführt.

Konzentrationen von Thrombospondin-1 (TSP1), Glutathion-S-Transferase Omega-1 (GSTO1), Inhibin-Beta-C-Kette (INHBC), Tetranectin (CLEC3B), extrazellulärem Matrixprotein 1 (ECM-1) und β-hCG im Serum von IP- und EP-Frauen werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Der t-Test wurde für unabhängige Proben der beiden Gruppen entsprechend den ELISA-Verifizierungsergebnissen durchgeführt und ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Der Hosmer-Lemeshow-Test wurde durchgeführt, um den Kalibrierungsgrad des Vorhersagemodells zu bewerten. Die ROC-Kurve wurde von GraphPad Software (San Diego, CA) erstellt und die Fläche unter der Kurve (AUC), Sensitivität, Spezifität, positiver Vorhersagewert und negativer Vorhersagewert wurden berechnet, um den diagnostischen Wert von EP zu bewerten.

Alle Probanden gaben vor ihrer Teilnahme an der Studie ihre Einverständniserklärung zur Aufnahme ab. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und das Protokoll wurde von der Ethikkommission des West China Second Hospital der Sichuan University (Nr. 124) genehmigt.

Alle für diese Studie generierten Datensätze sind im Artikel verfügbar.

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Wir möchten allen danken, die uns bei diesem Forschungsprojekt unterstützt haben.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Dan Ma und Ruiqing Yang.

Abteilung für Rehabilitationsmedizin, West China Second University Hospital, Sichuan-Universität, Chengdu, Sichuan, China

Dan Ma

West China Medical School der Sichuan-Universität, Chengdu, Sichuan, China

Dan Ma, Ruiqing Yang, Yunlong Chen, Zhengyi Huang und Yuxin Shen

Schlüssellabor für Geburtsfehler und damit verbundene Krankheiten von Frauen und Kindern (Universität Sichuan), Bildungsministerium, Chengdu, Sichuan, China

Dan Ma

Abteilung für Rehabilitationsmedizin, West China Hospital, Sichuan-Universität, Chengdu, Sichuan, China

Chengqi Er

Schlüssellabor für Rehabilitationsmedizin in der Provinz Sichuan, Chengdu, China

Chengqi Er

Staatliches Schlüssellabor für orale Erkrankungen, Nationales klinisches Forschungszentrum für orale Erkrankungen, Chengdu, Sichuan, China

Lixing Zhao

Abteilung für Kieferorthopädie, Westchinesisches Krankenhaus für Stomatologie, Sichuan-Universität, Chengdu, Sichuan, China

Lixing Zhao

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DM und RY haben das Manuskript verfasst. RY und YC führten die Laborverfahren durch. ZH führte die statistische Analyse durch. YS sammelte und analysierte Daten. CH und LZ haben das Experiment entworfen und das Manuskript kritisch überarbeitet. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Chengqi He oder Lixing Zhao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ma, D., Yang, R., Chen, Y. et al. Identifizierung nichtinvasiver diagnostischer Biomarker für Eileiterschwangerschaften mittels datenunabhängiger Akquisitionsproteomik (DIA): eine Pilotstudie. Sci Rep 12, 19992 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23374-8

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Eingegangen: 23. April 2022

Angenommen: 31. Oktober 2022

Veröffentlicht: 21. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23374-8

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Identifizierung nichtinvasiver diagnostischer Biomarker für Eileiterschwangerschaften anhand von Daten