Anwendung eines Dichtegradienten zur Isolierung der fäkalen mikrobiellen Stuhlkomponente und deren mögliche Verwendung

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 16807 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Die Idee, die Darmmikrobiota als virtuelles menschliches Organ zu betrachten, hat zum Konzept der fäkalen Mikrobiota-Transplantation (FMT) geführt, die in letzter Zeit äußerst erfolgreich bei der Behandlung von Fällen wiederkehrender Clostridium-difficile-Infektionen war. Die Verabreichung sicherer, lebensfähiger und repräsentativer fäkaler Mikrobiota ist für FMT von entscheidender Bedeutung. Nach unserem Kenntnisstand wurden geeignete Techniken und systematische Bedingungen zur Trennung der fäkalen Mikrobiota aus Stuhlproben nicht gründlich untersucht. In dieser Arbeit zeigen wir das Potenzial, Stuhlmikroorganismen mithilfe eines Verfahrens mit einem Nycodenz®-Dichtegradienten vom Rest des Fäkalienmaterials zu trennen, was 1010 lebensfähige Bakterien pro zwei Gramm Kot ergibt. Dieses Verfahren hatte keinen Einfluss auf die ursprüngliche Mikrobiota-Zusammensetzung in Bezug auf Lebensfähigkeit, Verteilung und Proportionen, wie durch einen phylogenetischen metagenomischen Ansatz beurteilt. Die Gewinnung der fäkalen Mikrobiota durch Konzentration und Trennung der Mikroorganismen von den übrigen Stuhlbestandteilen würde eine Standardisierung ihrer Erholung und ihre langfristige Erhaltung ermöglichen. FMT oder ähnliche Therapien zur Wiederherstellung der Mikrobiota könnten zur Behandlung verschiedener Erkrankungen oder sogar zu ästhetischen Zwecken eingesetzt werden, sodass die in unserer Arbeit beschriebene Methode dazu beitragen kann, die Grundlage für die Entwicklung sicherer und standardisierter Produkte zu schaffen.

Der menschliche Magen-Darm-Trakt (GI) ist ein komplexes Ökosystem, in dem die ansässigen Mikrobiota und Nährstoffe kontinuierlich mit Wirtszellen interagieren1. Die Darmmikrobiota besteht aus Billionen von Bakterien, die den eukaryotischen Zellen unseres Körpers um eine Größenordnung überlegen sind2 und die Idee, unsere Darmmikrobiota als virtuelles Organ zu betrachten, erfreut sich in der wissenschaftlichen Gemeinschaft immer größerer Beliebtheit3. Die von unserer Darmmikrobiota bereitgestellten Gene werden als „Darmmikrobiom“ bezeichnet, manchmal wird jedoch auch der Begriff „menschliches Mikrobiom“ (theoretisch das Genkomplement aller Mikroben, die in unserem Körper leben) als Synonym verwendet4. Mit fast 10.000.000 einzigartigen Genen, deutlich mehr als die „bescheidene“ Zahl von 21.000 menschlichen Genen5,6, ergänzt unsere Darmmikrobiota Stoffwechseleigenschaften, die in unserem Organismus fehlen, einschließlich der Fähigkeit, ansonsten nicht metabolisierbare Nährstoffe, die Produktion, zu nutzen von kurzkettigen Fettsäuren oder Vitaminen und vielen anderen7. Im Gegenteil: Der menschliche Wirt versorgt die Mikrobiota mit Nährstoffen, das heißt, unser Magen-Darm-Trakt ist eine Art Mikrobengarten, in dem jeder seine eigenen nützlichen Mikroben züchtet.

In den letzten Jahren liefern die großen Fortschritte der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien und deren Anwendung bei der Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften im Darm zunehmend Belege dafür, dass die Darmmikrobiota einen wichtigen Einfluss auf die erfolgreiche Reifung unseres Immunsystems und auf verschiedene Aspekte des Menschen hat Physiologie, die die Auslösung, das Fortschreiten und die Etablierung mehrerer Krankheiten umfassen kann. Die Profile der Darmmikrobiota werden nicht nur durch die Ernährung8,9, das Alter10 oder die geografische Lage11 beeinflusst, sondern auch die Veränderung der Zusammensetzung unserer Darmmikroorganismen wird mit einigen Darm- und Autoimmunerkrankungen wie Fettleibigkeit12, metabolischem Syndrom13, rheumatoider Arthritis14, Typ-1-Diabetes15 und entzündlichem Darm in Verbindung gebracht Krankheiten16 und systemischer Lupus erythematodes (SLE)17.

Wenn wir uns darüber einig sind, dass die menschliche Mikrobiota eines unserer Organe ist, wird schnell das Konzept der fäkalen Mikrobiota-Transplantation (FMT) aufkommen. In der wissenschaftlichen Literatur wurde FMT erstmals in den späten 1950er Jahren beschrieben18 und kann als „Abgabe von verarbeitetem Stuhl von einer gesunden Person in den Darm einer kranken Person durch Einlauf, Koloskopie oder auf andere Weise“19 definiert werden. Bemerkenswert ist, dass FMT eine beeindruckende Wirksamkeit (in einigen Fällen mehr als 90 % Erfolg) bei der Verdrängung wiederkehrender Clostridium-difficile-Infektionen aus dem Darm betroffener Personen, die nicht auf eine Antibiotikatherapie ansprachen, und bei der Wiederherstellung einer ausgeglichenen Darmmikrobiota aufwies20. Erst kürzlich wurde FMT erfolgreich zur Behandlung von Antibiotika-induzierter Kolitis eingesetzt21. Die Verallgemeinerung unregulierter FMT in bestimmten Bevölkerungsgruppen veranlasste die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA), Fäkalien als biologische Droge streng zu regulieren22.

Diese Eigenschaften von FMT auf die menschliche Darmgesundheit hatten große Auswirkungen auf die Gesellschaft, darunter Tausende von Einträgen in bekannten sozialen Netzwerken und Blogs sowie die Gründung von Stiftungen und anderen gemeinnützigen Organisationen, die sich der Förderung der FMT-Anwendung widmen ( zB http://thefecaltransplantfoundation.org/, http://thepowerofpoop.com/, http://www.openbiome.org/). Die aktuelle Methodik für FMT umfasst die Verarbeitung von frischem Spenderkot am selben Tag. Es wurden jedoch einige Protokolle veröffentlicht, um die Darmmikrobiota durch Mikrofiltration vom Rest des Fäkalienmaterials zu trennen und so beispielsweise deren Lagerung zu ermöglichen23. Nach diesem Protokoll werden die Darmmikrobiota zunächst in Gegenwart eines Kryoschutzmittels mikrofiltriert und dann bei –80 °C eingefroren. Dieses mikrobielle Präparat hat sich bei der Verdrängung von Clostridium difficile als ebenso wirksam erwiesen wie ein Frischkotpräparat, wie durch 16S-rRNA-Genprofilierung24 nachgewiesen wurde.

Die möglichen Anwendungen von FMT, abgesehen von wiederkehrenden C. difficile-Infektionen, sind zahlreich, verdienen jedoch Studien zur Normalisierung und Standardisierung der gesunden fäkalen Mikrobiota. Erstens könnte die Extraktion der Mikrobiota und ihre Trennung vom Rest des Stuhlmaterials unter kontrollierten Bedingungen dazu dienen, die unansehnliche Natur des Kots zu vermeiden. Zweitens könnte dies die langfristige Erhaltung der fäkalen Mikrobiota ermöglichen und ihre Vermehrung in Bioreaktoren ermöglichen, selbst viele Jahre nach ihrer Extraktion. Darüber hinaus erleichtert es Aufgaben wie die Stuhluntersuchung auf Viren (HIV, Hepatitis und andere), Parasiten und andere unerwünschte Mikroorganismen.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Anwendung eines Verfahrens zur Trennung von fäkalen Mikrobiota unter Verwendung eines Dichtegradienten. Mittels 16S-rDNA-Metagenomprofilierung konnten wir bestätigen, dass die gesamte mikrobielle Gemeinschaftsstruktur nach der Trennung vom Stuhl unverändert blieb. Auch mögliche Anwendungen dieser Methode zur langfristigen Erhaltung der Darmmikrobiota werden diskutiert.

Die Ethikgenehmigung für diese Studie wurde im Rahmen des Projekts AGL2010–14952 vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit („Auf dem Weg zu einem besseren Verständnis der Funktionalität von Darmmikrobiota bei einigen Immunerkrankungen“) eingeholt. Die endgültige Genehmigung wurde vom Bioethikausschuss des CSIC (Consejo Superior de Investigaciones Científicas) und vom regionalen Ethikausschuss für klinische Forschung (Servicio de Salud del Principado de Asturias) in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki eingeholt. Alle Bestimmungen wurden mit vollständig informierter schriftlicher Zustimmung aller an der Studie beteiligten Teilnehmer durchgeführt.

Stuhlproben aus dieser Studie wurden von fünf Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) und drei gesunden Kontrollpersonen entnommen, die aus einer früheren Studie ausgewählt wurden, in der die mit SLE verbundene Darmmikrobiota-Dysbiose beschrieben wurde17. Detaillierte klinische Daten und Ernährungsdaten dieser Teilnehmer können in der oben genannten Studie abgerufen werden. SLE-Patienten verwendeten in den 6 Monaten vor der Probenentnahme keine Antibiotika, Glukokortikoide, Immunsuppressiva, monoklonale Antikörper oder andere Immuntherapien.

Ein Teil jeder Stuhlprobe wurde einem Dichtegradienten ausgesetzt, um die Mikrobiota vom Rest des Stuhlmaterials zu trennen, entsprechend der Methode von Courtois und Kollegen mit einigen Modifikationen25. Zwei Gramm Kot wurden in 18 ml sterilem NaCl 0,9 % (Gew./Vol.) in einem Laborrührer (Stomacher Lab Blender 400, Seward Ltd. UK) 1 Minute lang homogenisiert. Eine Lösung von Nycodenz® 80 % (Gew./Vol.) (PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Dänemark) wurde in Reinstwasser hergestellt und 15 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Ein Volumen von 10,5 ml der verdünnten, homogenisierten Stuhlprobe wurde auf 3,5 ml der Nycodenz®-Lösung gegeben und 40 Minuten lang bei 4 °C (10.000 × g, TST41.14-Rotor, Kontron, Mailand, Italien) zentrifugiert. Die obere Phase, die lösliche Trümmer enthielt, wurde nach dem Zentrifugationsschritt verworfen und die Schichten, die den mit 10,5 ml PBS extrahierten Mikrobiota entsprachen (Abb. 1), wurden gesammelt. Zellsuspensionen wurden 5 Minuten lang auf Eis gehalten, um die Ausfällung unlöslicher Trümmer zu ermöglichen, wurden dann zweimal gewaschen und in Aliquots von 1 ml bei –80 °C gelagert, bis die DNA-Extraktion durchgeführt wurde. In allen Fällen wurde DNA direkt aus homogenisierten Stuhlproben oder aus den entsprechenden getrennten Mikrobiota-Fraktionen mit dem QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen Ltd., Straße, Deutschland) extrahiert, wie in einer früheren Arbeit26 beschrieben.

Arbeitsablauf des in dieser Arbeit verwendeten Versuchsaufbaus.

(A) Verdünnte homogenisierte Stuhlproben wurden auf eine Nycodenz®-Lösung geladen, wie im Abschnitt „Material und Methoden“ beschrieben. (B) Nach der Zentrifugation wurden vier Schichten gebildet. Durch die Untersuchung des Schichtinhalts in einem Phasenkontrastmikroskop konnten wir das Vorhandensein einer Schicht bestimmen, die der fäkalen Mikrobiota entspricht, zwischen zwei Schichten, die lösliche (obere) und unlösliche (untere) Fäkalienreste enthalten, die sich alle über dem Nycodenz befinden. (C) Lichtfotografie der Mikrobiota-Schicht, die eine große Vielfalt mikrobieller Größen und Formen zeigt. Balken, 10 μm.

Um die Ausbeute der Mikrobiota-Extraktion zu bewerten und die Lebensfähigkeit der gewonnenen Mikrobiota festzustellen, wurden drei zusätzliche Stuhlproben von drei gesunden Spendern vor und nach der Dichtegradientenextraktion mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zur Zählung der Bakterien wurden die Proben mit einem Durchflusszytometer (Cytomics FC500, Beckman-Coulter Inc., Miami, Florida, USA) mit dem Bakterienzählkit (InvitrogenTM, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) gemessen. Die absoluten Zählwerte in den Proben wurden anhand von mindestens 2.000 und höchstens 10.000 fluoreszierenden Standardkügelchen und entsprechend der Analyse der den Kügelchen entsprechenden Flächen bestimmt: lebende Bakterien (gefärbt mit Syto9) und tote Bakterien (gefärbt mit Propidiumiodid, Sigma, St. Louis, MO). Das Triggersignal wurde am Side Scatter (SSC)-Detektor ermittelt (wie vom Bacteria Counting Kit, Invitrogen empfohlen), und Fluoreszenzsignale wurden am FL1-Detektor (510–550 nm) für Syto9 und am FL4-Detektor (660–700 nm) für Propidium gesammelt Jodid. Als Negativkontrolle wurde mikrofiltriertes PBS verwendet. Zusätzlich behandelten wir zur Kontrolle abgestorbener Mikrobiota ein Aliquot der Stuhlproben 10 Minuten lang bei 98 °C und anschließend 15 Minuten lang unter UV-Licht-Exposition. Die Lebensfähigkeit der Mikrobiota in jeder Probe wurde als Prozentsatz lebender Bakterien in der fäkalen Mikrobiota vor und nach dem Nycodenz®-Extraktionsverfahren berechnet. Die absolute Anzahl der Bakterien wurde unter Verwendung der fluoreszierenden Perlen als interner Standard in jeder Probe berechnet, wobei die Empfehlungen des Lieferanten für die ratiometrische Zählung befolgt wurden. Die relativen Konzentrationen wurden als absolute Anzahl von Bakterien im Verhältnis zu Gramm der gesamten trockenen Fäkalienmasse ausgedrückt, die gemäß den FIL-IDF-Standards27,28 bestimmt wurde.

Partielle 16S-rRNA-Genamplikons wurden mit den Primern Probio_Uni und Probio_Rev (die auf die V3- und V4-Region abzielen) durch PCR erhalten, wie in früheren Arbeiten unserer Forschungsgruppe beschrieben17,26. Sequenzbibliotheken unter Verwendung des Ion Sequencing 200-Kits (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) wurden aus den gereinigten PCR-Produkten hergestellt und in einem Ion Torrent PGM-System in den Einrichtungen von GenProbio Ltd (http://www.genprobio) sequenziert. com). Nach der Sequenzierung wurden bestimmte Sequenzlesegruppen wie Sequenzen geringer Qualität und polyklonale Sequenzen von der PGM-Software entfernt. Sequenzen, die zum PGM 3′-Adapter passten, wurden ebenfalls automatisch zugeschnitten. Alle von PGM qualitätsgeprüften, beschnittenen und gefilterten Daten wurden als .sff-Dateien exportiert.

Die .sff-Dateien wurden mit QIIME 1.7.0 mit den in früheren Arbeiten26,29 beschriebenen Skripten und Verfahren verarbeitet. Im Rahmen der Qualitätskontrolle wurden nur Sequenzablesungen mit einer Länge zwischen 150 und 200 bp sowie mit einem mittleren Sequenzqualitätsscore von mehr als 25 berücksichtigt. Sequenzen wurden an der ersten Base gekürzt, wenn ein rollierendes 10-bp-Fenster von geringer Qualität gefunden wurde, und andere Sequenzen wie Homopolymere (>7 bp) oder Sequenzen mit nicht übereinstimmenden Primern wurden weggelassen. Um Downstream-Diversitätsmaße (Alpha- und Beta-Diversitätsindizes, Unifrac-Analyse) zu berechnen, wurden 16S rRNA Operational Taxonomic Units (OTUs) mit einer Sequenzhomologie von ≥97 % definiert und chimäre Sequenzen wurden mit Chimera Slayer30 entfernt. Alle Lesevorgänge wurden mithilfe von QIIME und einem Referenzdatensatz von GreenGenes (Version 13.5, Mai 2013, http://greengenes.secondgenome.com) dem niedrigstmöglichen taxonomischen Rang zugeordnet, aber im Allgemeinen war die Familienebene die niedrigste taxonomische Einheit, die in der gesamten Studie berücksichtigt wurde . OTUs wurden mithilfe von uclust mithilfe des mit QIIME bereitgestellten Skripts pick_de_novo_otus.py zugewiesen und im BIOM-Format für nachgelagerte Analysen exportiert31. Verschiedene Alpha-Diversity-Metriken (Chao, Observed Species, Shannon und Simpson) wurden aus den BIOM-formatierten Tabellen mithilfe des von QIIME bereitgestellten Skripts alpha_diversity.py berechnet.

16S-rRNA-Genprofile vor oder nach der Dichtegradientenextraktion wurden auf vier taxonomischen Ebenen (Stamm, Klasse, Ordnung und Familie) ausgewertet. Die Proben wurden nach ihren mikrobiellen Profilen mithilfe von drei verschiedenen und unbeaufsichtigten multivariaten Analysen geordnet: Hauptkomponentenanalyse (PCA), Hauptkoordinatenanalyse (PCO) und Korrespondenzanalyse (CA), implementiert in der Software PAST v3.032. Nach der Bestellung wurden die Proben nach dem für die DNA-Extraktion verwendeten Probentyp klassifiziert (Kot versus Mikrobiota, getrennt auf dem Nycodenz®-Dichtegradienten). An den multivariaten Daten wurden verschiedene statistische Tests durchgeführt, darunter Einweg-ANOSIM und Einweg-PERMANOVA, jeweils mit 9.999 Permutationen. Um Unterschiede in einzelnen taxonomischen Gruppen zu bewerten, wurden OTU-Tabellen im BIOM-Format auf den vier taxonomischen Ebenen reduziert, in tabulatorgetrenntem Textformat exportiert und mit STAMP v2.0.333 analysiert. Die Assoziation der Taxa mit dem für die DNA-Extraktion verwendeten Probentyp wurde durch die Durchführung zweiseitiger Welch-Tests für jedes Mittelwertpaar bewertet. Schließlich wurde die False Discovery Rate-Korrektur34 angewendet und signifikante Unterschiede in den Taxa zwischen den beiden Versuchsbedingungen wurden nur unter einem p-Wert von 0,05 und einem q-Wert unter 0,2 berücksichtigt, wie in früheren Arbeiten17,35. Schließlich wurde mit PAST v3.0 eine Ähnlichkeitsmatrix unter Verwendung des Jaccard-Index für alle Stichproben auf Familienebene erstellt. Ähnlichkeiten zwischen Proben wurden in Dendrogrammen dargestellt, die mit der Simple Linkage-Methode oder mit dem Neighbor Joining-Algorithmus (unter Verwendung von 9.999 Wiederholungen) erstellt wurden.

In den letzten Jahren hat das wachsende Interesse am Verständnis der Zusammensetzung der menschlichen Darmmikrobiota zu einem besseren Wissen darüber geführt, wie diese Mikrobenpopulationen im Rahmen bestimmter Krankheiten, insbesondere solcher mit autoimmunen oder entzündlichen Komponenten, verändert werden können. Die Darmflora gilt zunehmend als dynamisches Organ des menschlichen Körpers und kann daher zu therapeutischen Zwecken transplantiert werden. Bei allen gemeldeten Verabreichungswegen und -arten von FMT wird das Fäkalienmaterial (frisch oder gefroren) in einer Salzlösung verdünnt oder lyophilisiert, normalerweise unter nicht kontrollierten Atmosphären.

Die Trennung von Mikroben aus Fäkalien mithilfe von auf Dichtegradienten basierenden Methoden ist kein neues Konzept, da sie seit den 1970er Jahren zur Trennung von Bakterien aus dem Boden eingesetzt wird. Die ersten Trennprotokolle bestanden aus wiederholten Misch- und Zentrifugationsschritten in verschiedenen Puffern und Salzlösungen36,37. Später wurde die Bakterientrennung durch Zentrifugation auf modifizierten Saccharosegradienten38 oder durch Passage durch ein Kationenaustauscherharz (Jacobsen und Rasmussen, 1992) vorgeschlagen39. Die größte Einschränkung dieser Protokolle besteht darin, dass sie zeitaufwändig und daher schwierig in der Routineanalyse zu implementieren sind. Diese Einschränkung wird mit Nycodenz resine25 überwunden, obwohl keine Daten zur Lebensfähigkeit der Bakterien vorliegen. Im Rahmen der FMT bietet die Trennung der gastrointestinalen Mikrobiota vom Rest des Fäkalienmaterials den Vorteil, dass die hygienischen Bedenken aufgrund der unansehnlichen Beschaffenheit von Fäkalien verringert werden.

In dieser Arbeit wurden acht Stuhlproben aus einer früheren Forschungsarbeit zur Darmdysbiose im Rahmen von SLE17 ausgewählt. Diese Proben unterschieden sich hinsichtlich der Bakterienvielfalt, was sich in den unterschiedlichen Werten des Verhältnisses von Firmicutes zu Bacteroidetes widerspiegelte (FBR, niedriger bei SLE-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen; HC4 = 8,6, HC32 = 8,8, HC33 = 4,5, SLE2 = 1,6, SLE12 =). 1,0, SLE13 = 1,6, SLE21 = 1,2, SLE22 = 0,3). Interessanterweise wurden Veränderungen der FBR bei bestimmten menschlichen Erkrankungen wie Morbus Crohn, Typ-2-Diabetes oder Fettleibigkeit beobachtet. Der Grund für diese Wahl bestand darin, zu beurteilen, ob unsere Extraktionsmethode Proben mit unterschiedlichen FBRs beeinträchtigen könnte.

Bei unserem Ansatz wurde eine homogenisierte Stuhlverdünnung auf eine 80 % w/v Nycodenz®-Lösung geladen (Abb. 1A) und bei 10.000 × g zentrifugiert. Dies unterschied sich vom Ansatz von Rooijers et al.40, der der Methodik von Murayama et al.41 folgte, mit unterschiedlicher Nycodenz®-Gradientenpräparation und unterschiedlichen relativen Zentrifugenkraftwerten. Mikrobiota wurde in einem einzigen Zentrifugationsschritt vom Rest des Fäkalienmaterials getrennt. Wie in Abb. 1B zu sehen ist, wurden oben in der unlöslichen Trümmerschicht zwei Schichten beobachtet, die der mikrobiellen Biomasse entsprachen. Diese Ablagerungen erleichterten die Wiederherstellung der Mikroorganismen, nachdem die obere Phase der löslichen Ablagerungen entfernt worden war, da sie eine physikalische Barriere darstellten, die eine Vermischung der resuspendierten Mikrobiota mit der unteren Nycodenz®-Schicht verhinderte. Die verschiedenen Schichten wurden einer Kontrastphasenmikroskopie unterzogen und die überwiegende Mehrheit der Mikroorganismen wurde in den oben genannten beiden Schichten beobachtet (Abb. 1C).

Der Ansatz zur Bewertung der Effizienz des Nycodenz®-Extraktionsverfahrens zeigte, dass die Lebensfähigkeit der mit dem Dichtegradienten abgetrennten fäkalen Mikrobiota im Vergleich zu frischen fäkalen Mikrobiota in gutem Maße erhalten blieb (Suppl. Abb. 1). Im Durchschnitt waren in der Mikrobiota, die nach der Nycodenz®-Behandlung wiederhergestellt wurde, noch 66,9 % der Bakterien am Leben, wobei die Werte zwischen 71,3 und 60,6 % (66,9 ± 5,6) in den drei analysierten Stuhlproben lagen, während die Lebensfähigkeit in frischen Fäkalien auf geschätzt wurde Bereich zwischen 85,6–49,9 % (68,6 ± 17,9). Dies gibt einen Eindruck von der guten Effizienz der vorgeschlagenen Methodik zur Konzentration und Isolierung lebensfähiger Mikrobiota, unabhängig von den Schwankungen des Kots in Bezug auf Feuchtigkeit und Fasergehalt. Die Konzentrationen lebender Bakterien in den drei mittels Durchflusszytometrie analysierten Proben lagen zwischen 3,2 × 109 und 7,2 × 109 (5,2 ± 2,0 × 109) Bakterien/Gramm fäkaler Trockenmasse in den ursprünglichen Proben frischer Fäkalien und zwischen 5,7 × 109 und 9,0 × 109 (7,0 ± 1,8 × 109) pro Gramm Kot nach Dichtegradientenextraktion. Dies bedeutet, dass alle lebensfähigen Bakterien aus dem Fäkalienmaterial extrahiert werden, was einer Ausbeute von etwa 1010 lebensfähigen Bakterien pro zwei Gramm Stuhlprobe entspricht. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den mittleren Konzentrationen vor und nach der Behandlung festgestellt. Somit zeigten unsere Ergebnisse eine minimale Variabilität der lebensfähigen Mikrobiota, die bei verschiedenen einzelnen Spendern gewonnen wurde, und keinen Einfluss des Isolationsprotokolls auf die Integrität der Fäkalienbakterien.

Die Analyse der mithilfe des Dichtegradienten extrahierten Mikrobiota-Fraktionen führte zu einer allgemeinen Verringerung der Diversität im Vergleich zu den Ergebnissen, die mit der direkt aus Fäkalien extrahierten DNA erzielt wurden. Dies traf zu, als Alpha-Diversitätsindizes berechnet wurden, die nur den Artenreichtum berücksichtigen (Chao 1, Observed Species), aber das Gegenteil wurde bei Verwendung des Shannon-Index beobachtet, der die Artengleichmäßigkeit berücksichtigt (Shannon) (Abb. 2). . Mit dem Simpson-Index wurde kein Unterschied in der Alpha-Diversität festgestellt. Insgesamt bedeutet dies, dass die Anzahl der gewonnenen OTUs nach der Nycodenz®-Extraktion zwar geringer ist, die Anteile zwischen ihnen jedoch während des Extraktionsprozesses nicht unbedingt variiert haben. Es ist Vorsicht geboten, da eine Verringerung der Alpha-Diversität die Wirksamkeit von FMT beeinträchtigen könnte, da bestimmte Bakteriengruppen, die für das Gleichgewicht der Dysbiose wichtig sind, verloren gehen könnten. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um festzustellen, ob die Verringerung der OTUs/Arten teilweise auf die Sauerstoffexposition während der Manipulation der Mikrobiota-Trennung im Dichtegradienten zurückzuführen sein könnte. Es ist möglich, dass bestimmte Mikrobentypen, die anfälliger für Sauerstoff sind, geschützt werden, wenn die Extraktion der fäkalen Mikrobiota unter streng anaeroben Bedingungen durchgeführt wird. Es wird auch interessant sein zu klären, ob Nycodenz®-Gradienten bei der selektiven Entfernung unerwünschter Moleküle/Mikroorganismen wie Toxine, Prionen und Viren aus dem Kot hilfreich sind.

Verschiedene Alpha-Diversitätsindizes, die aus den Stuhlproben vor (dunkelgrau) oder nach (hellgrau) Mikrobiota-Trennung durch Dichtegradienten erhalten wurden.

Balken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar. (*p < 0,05; ***p < 0,001).

Um zu wissen, ob die beobachteten Unterschiede in der mikrobiellen Diversität zwischen den Proben, mit oder ohne Nycodenz®-Extraktion, für Clustering-Zwecke genutzt werden könnten, wurden die Proben anhand der taxonomischen Zusammensetzung auf Stamm- oder Familienebene mithilfe verschiedener Methoden geordnet: Hauptkomponentenanalyse ( PCA), Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) und Korrespondenzanalyse (CA) (Abb. 3). Bei unvoreingenommener Verwendung, dh ohne Bereitstellung von Informationen über die Quelle der verschiedenen mikrobiellen Profile, konnten alle Sortiermethoden die Proben in getrennte Gruppen gruppieren (Kot vs. extrahierte Mikrobiota) (Abb. 3). Das Fehlen einer Wirkung der Extraktionsmethode wurde im Nachhinein statistisch durch die Verwendung nichtparametrischer Tests wie Einweg-ANOSIM und Einweg-PERMANOVA aufrechterhalten. In beiden Fällen wurden die Proben zunächst nach ihrer Herkunft klassifiziert und ihre Ähnlichkeiten anhand euklidischer Abstände gemessen. Die erhaltenen p-Werte unterstützten nicht die Einteilung der Proben in zwei Gruppen (Kot vs. extrahierte Mikrobiota; einfaktorielles ANOSIM; p-Wert 0,733; einfaktorielle PERMANOVA; p-Wert 0,353).

Es wurden verschiedene unvoreingenommene multivariate Sortiermethoden verwendet, um zu bestimmen, ob die Mikrobenpopulationen direkt aus homogenisierten Stuhlproben (schwarze Punkte) oder aus den getrennten fäkalen Mikrobiota (graue Quadrate) stammen und entsprechend ihrer Zusammensetzung gruppiert wurden.

Ellipsen stellen die geschätzte Region dar, in der voraussichtlich 95 % der Bevölkerungspunkte sinken würden. Die Analysen wurden auf Stamm- und Familienebene durchgeführt. PCA: Hauptkomponentenanalyse; PCoA, Hauptkoordinatenanalyse; CA, Korrespondenzanalyse.

Um die Auswirkung der mikrobiellen Trennung durch Dichtegradienten auf die 16S-RNA-Genprofilierung weiter zu untersuchen, wurde eine Ähnlichkeitsmatrix unter Verwendung der relativen Familienhäufigkeiten durch Berechnung von Jaccard-Abständen erstellt, eine Methode, die bereits in anderen metagenomischen Studien verwendet wurde42. Die Proben wurden unter Verwendung dieser Abstände zwischen den Proben gemäß der Simple Linkage-Methode oder mithilfe des Neighbor Joining-Algorithmus geclustert und die entsprechenden Dendrogramme erhalten (Abb. 4). In beiden Fällen wurden Proben, deren DNA nach der Mikrobiota-Trennung extrahiert wurde, mit den entsprechenden Kotproben geclustert, mit Ausnahme der Proben LS12 und HD33. In diesen Proben war der Effekt der Mikrobiota-Extraktion auf die metagenomischen Profile höher, wobei einige Gruppen drastische Veränderungen auf Stamm- oder Familienebene zeigten (Suppl. Abb. 2). Diese Ergebnisse bestätigten, dass die mit dem Dichtegradientenzentrifugationsverfahren extrahierten mikrobiellen Gemeinschaften im Allgemeinen repräsentativ für die in der ursprünglichen Stuhlprobe vorhandenen sind.

Dendrogramme, die die Ähnlichkeit von Proben gemäß Jaccard-Abständen zeigen; (A) Clustering durch einfache Verknüpfung; (B) Clustering unter Verwendung von Neigbour Joining mit Zweigunterstützung (10.000 Wiederholungen). Die Suffixe NEW und OLD bezeichnen Proben, bei denen Mikrobiota vor der DNA-Extraktion im Dichtegradienten extrahiert bzw. nicht extrahiert wurden.

Die Trennung von Mikroorganismen mithilfe eines Nicodenz®-Dichtegradienten wurde erstmals von Lindahl und Bakken43 zur Isolierung von Bakterien aus dem Boden eingeführt. Diese Methode wurde auch in anderen biologischen Systemen erfolgreich angewendet, beispielsweise bei der Beschreibung des Darmmetagenoms des Palmrüsslers (Rhynchophorus ferrugineus)44 oder bei der Genexpressionsbewertung in Milchmatrizen45. Die Trennung von Bakterien von bestimmten Matrixverbindungen kann für nachgelagerte molekularbiologische Anwendungen sehr nützlich sein, da dieser Schritt viele der Komponenten entfernt, die die PCR hemmen, wie etwa Huminstoffe oder farbige Substanzen, die die Blot-Hybridisierungsprotokolle stören46.

In unserer Arbeit wurde gezeigt, dass die Anwendung dieser Methode keinen Einfluss auf die globale Variabilität der extrahierten Mikrobiota hat und die Vielfalt der Bakterien, die direkt aus dem Boden oder nach dem Nycodenz®-Gradienten extrahiert wurden, mit Ausnahme von γ-Proteobakterien25 nicht signifikant unterschiedlich war. Allerdings zeigten einige taxonomische Gruppen erhebliche Unterschiede entsprechend der Gradientenextraktion, wenn die Gesamtheit der Proben gruppiert und analysiert wurde (Tabelle 1). Im Allgemeinen zeichneten sich 16S-rRNA-Genprofile aus Proben, in denen Mikrobiota im Nycodenz®-Gradienten extrahiert wurden, durch eine höhere relative Häufigkeit des Firmicutes-Stamms aus, was auf eine höhere Wiederfindung der Clostridiales-Ordnung zurückzuführen ist (Suppl. Abb. 3). Mehrere Gruppen aus den Beta-, Delta- und Epsilon-Abteilungen der Proteobacteria-Phyla zeigten ebenfalls signifikante Unterschiede je nach Behandlung, wenn auch in geringerem Ausmaß.

Im Allgemeinen bietet die in dieser Arbeit vorgestellte Methodik eine einfache und unkomplizierte Methode zur Extraktion und Trennung der fäkalen Mikrobiota von den übrigen Stuhlbestandteilen, was weitere Verbesserungen ermöglicht, beispielsweise die Durchführung dieses Prozesses unter kontrollierten atmosphärischen Bedingungen. Darüber hinaus kann dieser Extraktionsschritt einige unerwünschte Bestandteile des Kots beseitigen, dies bedarf jedoch weiterer Forschung. Unser Ansatz könnte bei der Gewinnung repräsentativer Darmmikrobiota ohne Stuhlmaterial für Langzeitlagerungszwecke von Nutzen sein. Dies könnte auch als erster Schritt zur Erhaltung der gesamten mikrobiellen Gemeinschaften hilfreich sein und in naher Zukunft bei der Entwicklung mikrobiotabasierter Produkte/Vehikel für FMT und neuartige Biotherapien zur Darmwiederherstellung zum Einsatz kommen. Allerdings sind weitere Verbesserungen dieser Methode erforderlich, da beispielsweise einige Clostridium-verwandte OTUs durch die Nycodenz®-Extraktion erheblich beeinträchtigt wurden und einige Mitglieder dieser Gattung wie C. scindens bei der CDI-Behandlung relevant sein können47. Darüber hinaus sind Tierversuche erforderlich, um zu zeigen, dass nach dieser Methode extrahierte Mikrobiota effektiv in den Wirt eingepflanzt werden.

Interessanterweise kann dieses Protokoll erweitert werden, sodass größere Fäkalienmengen mit Zentrifugalgeräten mit höherer Kapazität verarbeitet werden können. Beispielsweise können 430 Gramm Fäkalienmaterial mit Schwingrotoren (bis zu 30.000 × g) verarbeitet werden, wobei 4 × 1000-ml-Eimer zugeteilt werden, mit einer erwarteten Ausbeute von 1012 lebensfähigen Bakterien.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Gewinnung der repräsentativen Mikrobiota aus dem Kot eines gesunden Spenders unter Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Nycodenz®-Dichtegradienten die Konzentration der Darmmikrobiota ermöglichen und diese von den übrigen Stuhlbestandteilen getrennt halten würde, während gleichzeitig ein hohes Lebensfähigkeitsniveau aufrechterhalten würde. Einerseits ist Nycodenz® im Hinblick auf die Toxizität für den Menschen ein sicheres Molekül, das bei der Mikrobiota-Extraktion leicht aus Proben entfernt werden kann. Im Vergleich zu anderen Molekülen, die zur Dichtegradientenisolierung verwendet werden, weist die röntgendichte Verbindung Nycodenz® Vorteile auf, wie z. B. eine nicht hemmende Wirkung auf die Aktivität der meisten Enzyme, Kompatibilität mit Proteinbestimmungstests und was für den Zweck relevant ist In diesem Artikel zeigt es eine geringe Toxizität beim Menschen41. Andererseits ermöglicht der Dichtegradient die Gewinnung repräsentativer und lebensfähiger fäkaler Mikrobiota und die Unterdrückung unerwünschter Mikroorganismen/Verbindungen sowie die Erleichterung der Untersuchung der Proben auf gefährliche Stoffe. Dies könnte die Entwicklung nachgelagerter Anwendungen wie mikrobiotabasierter Therapiestrategien zur mikrobiellen Darmsanierung ermöglichen, sowohl im Rahmen einer bestimmten Krankheit als auch für andere Anwendungen.

Zitierweise für diesen Artikel: Hevia, A. et al. Anwendung eines Dichtegradienten zur Isolierung der fäkalen mikrobiellen Stuhlkomponente und deren mögliche Verwendung. Wissenschaft. Rep. 5, 16807; doi: 10.1038/srep16807 (2015).

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Diese Forschung wurde durch die Zuschüsse AGL2010-14952, AGL2013-44039-R, AGL2013-44761-P und BIO2014-55019-JIN des spanischen „Plan Estatal de I + D + I“ und durch den Zuschuss EM2014/046 des „Plan galego de investigación, innovación e crecemento 2011–2015“. Borja Sánchez und Arancha Hevia erhielten einen Ramón y Cajal-Postdoktorandenvertrag bzw. ein FPI-Stipendium des spanischen Ministeriums für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit.

Abteilung für Mikrobiologie und Biochemie von Milchprodukten, Institut für Milchforschung (IPLA-CSIC), Paseo Río Linares s/n, 33300 Villaviciosa, Asturien, Spanien

Arancha Hevia, Susana Delgado, Abelardo Margolles und Borja Sánchez

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AM und BS haben die Forschung konzipiert. AH, SD und BS führten die Experimente durch und verfassten den Haupttext des Manuskripts. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 01. April 2015

Angenommen: 20. Oktober 2015

Veröffentlicht: 19. November 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16807

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