Th17-Reaktionen und natürliche IgM-Antikörper hängen mit der Zusammensetzung der Darmmikrobiota bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes zusammen

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 24072 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) wurde über eine Darmdysbiose berichtet, die durch ein verringertes Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis gekennzeichnet ist. In dieser Studie zeigten In-vitro-Kulturen, dass aus Stuhlproben von SLE-Patienten (SLE-M) isolierte Mikrobiota die Lymphozytenaktivierung und Th17-Differenzierung von naiven CD4+-Lymphozyten stärker förderten als gesunde Kontrollmikrobiota. Die Anreicherung von SLE-M mit Treg-induzierenden Bakterien zeigte, dass eine Mischung aus zwei Clostridia-Stämmen das Th17/Th1-Gleichgewicht deutlich reduzierte, während die Ergänzung mit Bifidobacterium bifidum eine Überaktivierung der CD4+-Lymphozyten verhinderte, was einen möglichen therapeutischen Nutzen von Probiotika mit Treg-induzierenden Stämmen unterstützt um das bei SLE vorhandene Treg/Th17/Th1-Ungleichgewicht wiederherzustellen. Tatsächlich zeigten Ex-vivo-Analysen von Patientenproben vergrößerte Th17- und Foxp3+-IL-17+-Populationen, was auf eine mögliche Treg-Th17-Transdifferenzierung schließen lässt. Darüber hinaus ergaben Analysen der fäkalen Mikrobiota eine negative Korrelation zwischen IL-17+-Populationen und Firmicutes bei gesunden Kontrollpersonen, wohingegen dieser Stamm bei SLE direkt mit den Serumspiegeln von IFNγ korrelierte, einem Th1-Zytokin, das bei Patienten leicht reduziert war. Schließlich war die Häufigkeit von Synergistetes, die positiv mit dem Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis bei gesunden Kontrollpersonen korrelierte, bei Patienten tendenziell geringer, wenn die Anti-dsDNA-Titer erhöht wurden, und zeigte eine starke negative Korrelation mit den IL-6-Serumspiegeln und korrelierte positiv mit dem natürlichen Schutz IgM-Antikörper gegen Phosphorylcholin.

Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine chronische Autoimmunerkrankung, die durch eine Kombination aus Umwelt- und genetischen Faktoren ausgelöst wird und zu einem Zusammenbruch der Toleranz gegenüber Selbstantigenen führt1. Die anschließende Produktion von Autoantikörpern durch autoreaktive B-Zellen stellt einen zentralen pathologischen Faktor bei SLE dar, da sie zur Bildung und Ablagerung von Immunkomplexen führt, die Gewebeschäden verursachen2. Ebenso können naive CD4+-Zellen, die durch die Erkennung solcher Selbstantigene aktiviert werden, basierend auf dem Muster der in der lokalen Umgebung vorhandenen Zytokine in mehrere Untergruppen differenziert werden3. Zusätzlich zum bekannten Paradigma der Immunantwort von Th1/Th2-Zellen gibt es heutzutage viele Hinweise auf das Vorhandensein von Veränderungen in Th17- und regulatorischen T-Zellen (Treg) bei der SLE-Erkrankung4,5,6. In Bezug auf Th17-Zellen belegen einige Studien ihre zentrale Rolle als primäre Treiber von Autoimmunreaktionen bei SLE durch die Sekretion proinflammatorischer Zytokine, die an lokalen Entzündungen und Gewebezerstörung beteiligt sind, darunter IL-17, IL-22 und IL-237,8. Dementsprechend wurde kürzlich über erhöhte zirkulierende Mengen an IL-17 und IL-17-produzierenden T-Zellen bei SLE9,10,11 berichtet. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass IL-17-produzierende T-Zellen auch bei Lupus-Patienten in die Lunge, die Haut und die Nieren eindringen und so zur Organschädigung beitragen10,12. Umgekehrt sind Treg-Zellen für die Vorbeugung von Autoimmun- und Entzündungskrankheiten unerlässlich, da sie eine unterdrückende Wirkung auf anomale Effektorreaktionen haben13. Natürlich vorkommende Treg-Zellen entstehen aus der Thymusdrüse und zeichnen sich vor allem durch das Vorhandensein hoher Mengen an CD25 (IL2Rα-Kette) und FOXP3 aus, einem Transkriptionsfaktor, der für die Entwicklung und Funktion von Treg-Zellen erforderlich ist14. Darüber hinaus könnten Treg-Zellen als Reaktion auf verschiedene Antigene in peripheren Geweben expandiert oder induziert werden15. Die meisten Studien berichten entweder über eine verringerte Anzahl oder eine beeinträchtigte Funktion der zirkulierenden Treg-Zellen bei SLE-Patienten16,17,18.

Zunehmende Hinweise deuten darauf hin, dass die Zusammensetzung der kommensalen Mikrobiota, die den Darm besiedelt, die Differenzierung von Immunzellen beeinflusst, die in den Darm-assoziierten Lymphgeweben (GALTs) vorhanden sind19. Insbesondere sind Plasmazellen in der Lamina propria an der Produktion von T-Zell-unabhängigen Antikörpern gegen Bestandteile kommensaler und pathogener Bakterien sowie apoptotischer Zellen beteiligt, die als natürliche IgM-Antikörper bezeichnet werden20. Interessanterweise haben mehrere Studien über immunregulatorische Funktionen natürlicher IgM-Antikörper berichtet, die die Entzündungssignale in angeborenen Immunzellen hemmen und Autoimmunerkrankungen unterdrücken21,22. Andererseits können dendritische Zellen (DCs) des Darms nach der Erkennung bakterieller Antigene die Differenzierung naiver CD4+-T-Zellen in verschiedene Arten von Effektor- oder regulatorischen T-Zellen induzieren23,24,25,26. Unter physiologischen Bedingungen begünstigt die normale Mikrobiota gesunder Personen die Aufrechterhaltung der intestinalen Immunhomöostase27. Umgekehrt deuten mehrere Studien darauf hin, dass Veränderungen in der Zusammensetzung der Darmmikrobiota, bekannt als Dysbiose, ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung zahlreicher immunvermittelter Pathologien sein können, wahrscheinlich bei krankheitsanfälligen Wirten, indem sie ein Ungleichgewicht zwischen Th- und Treg-Zellen erzeugen19 ,28,29,30,31. In diesem Sinne wurde Darmdysbiose mit der Entwicklung mehrerer Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht, darunter entzündliche Darmerkrankungen, Typ-1-Diabetes, rheumatoide Arthritis und Multiple Sklerose32,33,34,35,36,37,38. In diesem Zusammenhang haben wir kürzlich eine SLE-assoziierte Darmdysbiose beschrieben, die durch ein deutlich geringeres Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes gekennzeichnet ist, der am häufigsten vorkommenden Phyla im menschlichen Darm39, die zuvor bei anderen Erkrankungen als unausgeglichen beschrieben wurde37,38,40. Da diese Studien darauf hindeuten, dass Mikrobiota die Th/Treg-Achse außerhalb des Darms kontrollieren könnten, könnte die Immunstimulation durch bestimmte Bakterien einen positiven Effekt auf entzündliche Erkrankungen haben33. Daher ist bekannt, dass einige Bakterienstämme die Bildung von Treg-Zellen (iTreg) aus naiven Vorläufern induzieren könnten23,41,42,43. Insbesondere häufen sich Beweise für die Rolle kommensaler Stämme von Bifidobacterium und Clostridium spp. Zugehörigkeit zu den Clustern IV und XIVa bei der Induktion von Treg-Zellen23,41,42,43.

Ziel der Studie ist es, den Einfluss der fäkalen Mikrobiota von SLE-Patienten und gesunden Kontrollpersonen auf die In-vitro-Differenzierung von Th- und Treg-Populationen sowie den möglichen Effekt der Anreicherung der SLE-Darmmikrobiota mit Bifidobakterien und Clostridienstämmen zu bewerten, die als Induktoren von Treg-Zellen bekannt sind . Anschließend analysierten wir den möglichen Zusammenhang zwischen der SLE-assoziierten Darmdysbiose und dem Vorhandensein von Immunparametern, die für diese Patienten charakteristisch sind, wie z. B. die Treg/Th-Populationen, Zytokinspiegel, Krankheitsaktivität und die Produktion sowohl pathogener Anti-dsDNA als auch schützender natürlicher DNA IgM-Anti-Phosphorylcholin-Antikörper.

Angesichts der kürzlich bei SLE-Patienten gemeldeten Darmdysbiose39 wollten wir den Einfluss fäkaler Mikrobiota von SLE-Patienten (SLE-M) und gesunden Kontrollpersonen (HC-M) auf die In-vitro-Differenzierung regulatorischer T-Zellen (Treg) bewerten sowie Th1- und Th17-Effektorpopulationen aus naiven CD4+ T-Lymphozyten. Um außerdem die Wirkung der Anreicherung der Darmmikrobiota mit Stämmen abzuschätzen, die in der Lage sind, die Treg-Untergruppe zu erhöhen, wurden 5, 10 oder 30 % von SLE-M durch die gleichen Mengen von Bifidobacterium bifidum LMG13195 (Bb) ersetzt, einem Stamm, der bekanntermaßen induziert Foxp3-Expression23,41 oder mit einer Mischung aus zwei Clostridia-Stämmen (Cl) mit mutmaßlicher Treg-induzierender Wirkung (Ruminococcus obeum DSM25238 und Blautia coccoides DSM935)42,43. Daher wurden unreife, von Monozyten abgeleitete DCs 48 Stunden lang mit LPS als Reifungskontrolle oder mit den verschiedenen Bakterienpräparaten behandelt und dann zum Primen von CD4+CD45RA+-naiven T-Lymphozyten verwendet. Nach 12-tägiger Kultur in Gegenwart von IL-2 wurden Treg-Populationen (CD4+CD25highCD127lowFoxp3+), Th17 und Th1 (IFNγ- bzw. IL-17-exprimierende Zellen) durch Durchflusszytometrie in CD4+-Lymphozyten bestimmt.

Wie erwartet induzierte die Stimulation und Expansion mit IL-2 die IL-2Rα (CD25)-Expression in den meisten CD4+-Lymphozyten (Abb. 1A), allerdings zeigte die Menge der Zellen mit erhöhten CD25-Spiegeln (CD25high) Unterschiede zwischen den Behandlungen (Abb. 1B). Insbesondere neigten SLE-M-Kulturen dazu, mehr CD25-reiche Zellen zu erzeugen als HC-M-Kulturen, wohingegen die niedrigsten Werte dieser Population nach Stimulation mit dem Bb-Stamm erhalten wurden. Tatsächlich wurde die hochregulierende Wirkung von SLE-M auf die CD25-Expression nach einer Bb-Supplementierung umgekehrt. Bezüglich Treg-Zellen (CD4+CD25hoch CD127niedrigFoxp3+) wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen HC-M- oder SLE-M-Stimulation beobachtet. Allerdings war der Anteil der in der CD25high-Population enthaltenen Foxp3+-Zellen in SLE- als in HC-M-abgeleiteten Kulturen geringer (Abb. 1C), was darauf hindeutet, dass es sich bei einem Teil der in Gegenwart von SLE-M erzeugten CD25high-Zellen eher um aktivierte Lymphozyten handelte als Treg-Zellen. Obwohl Bb die Foxp3+-Zellen deutlich erhöhte, erhöhte die Ergänzung von SLE-M mit diesem Stamm unerwarteterweise nicht die Bildung von Foxp3+-Zellen innerhalb der CD25high-Untergruppe.

Naive CD4+CD45RA+-Lymphozyten wurden 12 Tage lang mit DC, die zuvor mit LPS gereift waren (Reifungskontrolle), fäkaler Mikrobiota, die aus gesunden Kontrollpersonen (HC-M) oder SLE-Patienten (SLE-M) isoliert wurden, sowie mit Bifidobacterium bifidum LMG13195 ( Bb), Clostridienstämme (Cl) oder SLE-M mit 5, 10 oder 30 % Bb oder Cl. Kultivierte CD4+-T-Zellen wurden gewonnen, auf Treg-Marker, IL-17 und IFNγ gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A) Sequentielle Gating-Strategie zur Identifizierung von Treg-Zellen (CD4+CD25highCD127lowFoxp3+). Positive Zellen für jeden Marker wurden unter Verwendung der Fluoreszenz von Zellen bestimmt, die mit dem entsprechenden Isotyp-angepassten konjugierten irrelevanten MAb als Negativkontrolle markiert waren. CD4+ T-Zellen mit der höchsten CD25-Expression wurden als CD4+CD25high identifiziert. Anschließend wurde die CD25high-Population analysiert, um den Anteil der Foxp3 exprimierenden Zellen (Foxp3+ innerhalb von CD25high) sowie die Menge an Treg-Zellen (CD25highCD127lowFoxp3+) zu bestimmen. Dichtediagramme entsprechen einem repräsentativen Experiment. Analysen von (B) CD25high-Population, (C) Foxp3+-Zellen innerhalb der CD25high-Population und (C) IL-17/IFNγ-Expression. Die Balken stellen den Mittelwert und die SEM von sieben unabhängigen Experimenten dar, die mit verschiedenen Blutspendern durchgeführt wurden. Statistische Unterschiede zwischen SLE-M und den verschiedenen Behandlungen wurden mit dem Wilcoxon-Test für gepaarte Daten ausgewertet. *p < 0,1; **p < 0,05.

Obwohl keine signifikanten Unterschiede in der IL-17- oder IFNγ-Expression zwischen Zellen festgestellt wurden, die mit beiden fäkalen Mikrobiota behandelt wurden, war das IL-17/IFNγ-Verhältnis in SLE-Kulturen signifikant höher als in HC-M-Kulturen, während das niedrigste Verhältnis durch induziert wurde Cl-konditionierte DCs. Darüber hinaus führte die SLE-M-Supplementierung mit Cl, jedoch nicht mit Bb, zu einer signifikanten dosisabhängigen Verringerung des IL-17/IFNγ-Gleichgewichts (Abb. 1D). Daher scheint die In-vitro-Stimulation naiver CD4+ T-Zellen mit SLE-M die Lymphozytenaktivierung und Th17-Differenzierung stärker zu fördern als die HC-M-Behandlung und unterstützt somit Th17/Treg-Störungen bei SLE. Darüber hinaus kann die Anreicherung der SLE-Mikrobiota mit Bb die Lymphozytenaktivierung verhindern, während eine Cl-Supplementierung das Th17/Th1-Gleichgewicht wiederherstellt.

Um zu wissen, ob die in vitro durch SLE-M hervorgerufenen Treg/Th-Reaktionen die charakteristischen Immunmerkmale von SLE-Patienten widerspiegeln könnten, analysierten wir die Foxp3-, CD25-, CD127-, IL-17- und IFNγ-Expression in frischen CD4+-Lymphozyten aus peripherem Blut sowie im Serum Konzentrationen einer Reihe von Zytokinen bei 37 SLE-Patienten und 36 HC (Tabelle 1). Da 40 dieser Personen (20 SLE und 20 HC) zuvor in eine metagenomische Studie der fäkalen Mikrobiota39 einbezogen wurden (Tabelle 2), haben wir außerdem den möglichen Zusammenhang zwischen diesen Immunparametern und der SLE-assoziierten Darmdysbiose ermittelt.

Die Ergebnisse zeigten eine erhöhte Häufigkeit von Th17-Zellen bei SLE-Patienten im Vergleich zu HC, insbesondere bei Patienten mit Anti-dsDNA-Antikörpern, während in der Th1-Untergruppe keine signifikanten Unterschiede beobachtet wurden (Abb. 2A). Darüber hinaus waren doppelt positive Foxp3+ IL-17+-Zellen bei SLE-Patienten im Vergleich zu HC signifikant erhöht, wobei die höchsten Werte dieser Zellen wiederum bei den Patienten beobachtet wurden, die Anti-dsDNA-Antikörper aufwiesen (Abb. 2B). Es wurden keine signifikanten Unterschiede im Prozentsatz der Treg-Zellen festgestellt (CD4+ CD25hoch CD127niedrigFoxp3+), was darauf hindeutet, dass ein Treg-Th17-Transdifferenzierungsprozess an der Entwicklung von Foxp3+-Zellen ohne regulatorische Aktivität bei SLE-Patienten beteiligt sein könnte.

Die Foxp3-, CD25-, CD127-, IL-17- und IFNγ-Expression wurde in frischen CD4+-Lymphozyten aus peripherem Blut von SLE-Patienten und HC analysiert. (A) Punktdiagramme zeigen Zellen, die für die IL-17- oder IFNγ-Expression positiv sind, bestimmt unter Berücksichtigung der Fluoreszenz von Zellen, die mit dem entsprechenden Isotyp-angepassten konjugierten irrelevanten MAb als Negativkontrolle markiert sind. Streudiagramme stellen den Prozentsatz von IL-17+ (Th17) und IFNγ+ (Th1) CD4+-Zellen bei HC- und SLE-Patienten dar, die Anti-dsDNA-Antikörper (aDNA) aufweisen (pos) oder nicht (negativ). Horizontale Balken zeigen den Median. (B) Treg-Zellen wurden nacheinander als CD4+CD25highCD127lowFoxp3+-Zellen identifiziert. Streudiagramme stellen die Menge an Treg-, Foxp3+ IL-17+- und Foxp3+ IFNγ+-Zellen bei HC- und SLE-Patienten in Abhängigkeit von ihrem Anti-dsDNA-Status dar, und horizontale Balken zeigen den Median. Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den Kruskal-Wallis-Test ausgewertet und der Dunn-Post-Test wurde durchgeführt, um festzustellen, welche Gruppenpaare unterschiedliche Mittelwerte aufwiesen. **p < 0,01; ***p < 0,001.

Andererseits ergab die Analyse der fäkalen Mikrobiota in der HC-Gruppe eine negative Korrelation zwischen der Häufigkeit von Firmicutes und der Größe der Th17-Untergruppe, insbesondere in Foxp3+ IL-17+-Zellen, während bei Bacteroidetes das Gegenteil auftrat (Tabelle 3). ); Alle diese Korrelationen wurden durch multivariate lineare Regressionsanalysen bestätigt, angepasst an Gewicht, BMI und Blutfette (*p < 0,05, R2 > 0,6). Allerdings fehlten solche Zusammenhänge bei den Patienten völlig, was mit unserer zuvor beschriebenen Verringerung des Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnisses bei SLE übereinstimmt.

Bezüglich der Zytokinserumspiegel zeigten SLE-Patienten höhere Mengen an IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IFNα, TNFα, GM-CSF, BLyS und Leptin als HC, wohingegen IFNγ eine deutliche Tendenz zur Reduktion zeigte (Abb. 3A). Interessanterweise zeigte keines der erhöhten oder unveränderten Zytokine bei SLE einen signifikanten Zusammenhang mit Firmicutes oder Bacteroidetes, jedoch korrelierten die IFNγ-Spiegel negativ mit Bacteroidetes und positiv mit Firmicutes und dem Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis bei Patienten (Abb. 3B). Diese Assoziationen wurden in HC nicht festgestellt.

(A) Box und Whiskers stellen den mittleren und interquartilen Bereich der zirkulierenden Mengen an Zytokinen bei SLE-Patienten im Vergleich zu Kontrollen dar. Unterschiede zwischen beiden Gruppen wurden mit dem nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test bewertet. (B) Korrelationen zwischen den Serumspiegeln von IFNγ und der Häufigkeit von Firmicutes, Bacteroidetes oder dem Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes (F/B) bei SLE-Patienten wurden mithilfe des Spearman-Tests bewertet.

Wie wir zuvor berichteten39, zeigte der Anteil fäkaler Synergistetes keine signifikanten Unterschiede zwischen SLE-Patienten und gesunden Kontrollpersonen. Wir fanden jedoch einen negativen Korrelationstrend zwischen dieser Bakteriengruppe und dem Titer von Anti-dsDNA-Antikörpern (r = –0,386, p = 0,084), der bei keiner anderen der zuvor analysierten Mikrobengruppen festgestellt wurde. Ebenso korrelierten die Serumspiegel von IL-6 negativ mit der Menge an Synergistetes bei SLE-Patienten (r = −0,738, p < 0,001), was auf einen möglichen Zusammenhang zwischen dieser Bakteriengruppe und der Krankheitsaktivität oder Antikörperproduktion schließen lässt. Um das Wissen über die mögliche Rolle von intestinalen Synergisteten bei der Entwicklung humoraler Immunantworten zu erweitern, haben wir daher die Serumspiegel von Anti-PC-IgM, natürlichen Schutzantikörpern und Anti-PC-IgG (ohne diesen Effekt) quantifiziert Gesamtes zirkulierendes IgM und IgG. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den Anti-PC-Antikörpern (IgM und IgG) und dem Gesamt-IgM zwischen Patienten und Kontrollen festgestellt, aber die Menge an Gesamt-IgG war bei Patienten im Vergleich zu Kontrollen erhöht (p = 0,027). Interessanterweise korrelierte der Anti-dsDNA-Titer negativ mit beiden Isotyp-Anti-PC-Antikörpern (IgM: r = −0,508, p = 0,019; IgG: r = −0,460, p = 0,036) und mit dem Gesamt-IgM (r = −0,501, p =). 0,021), nicht aber IgG-Spiegel (r = 0,065, p = 0,780), was auf eine schädliche Wirkung der SLE-Krankheitsaktivität auf natürlich vorkommende schützende IgM-Antikörper schließen lässt.

Andererseits zeigten Synergistetes eine positive Korrelation mit dem Gesamt- und Anti-PC-IgM bei SLE-Patienten und mit dem Gesamt- und Anti-PC-IgM/IgG-Verhältnis bei Patienten und Kontrollpersonen (Tabelle 4). Interessanterweise zeigten die Serumspiegel von IL-6 bei Patienten den gegenteiligen Zusammenhang. Alle diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass intestinale Synergisteten die Entwicklung schützender natürlicher IgM-Antikörper fördern können, ein Effekt, der besonders bei SLE-Patienten relevant ist, da die erhöhten Anti-dsDNA- und/oder IL-6-Spiegel diese Bakteriengruppe herunterregulieren könnten.

Schließlich ist es bemerkenswert, dass Synergistetes negativ mit Bacteroidetes (r = −0,486, p = 0,022) und positiv mit dem Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis (r = 0,443, p = 0,039) bei den Kontrollpersonen korrelierte, nicht jedoch bei SLE-Patienten (r = 0,075). , p = 0,745 bzw. r = −0,136, p = 0,556), was die Rolle dieser Bakteriengruppen bei SLE unterstützt.

Darmdysbiose wurde mit mehreren immunvermittelten Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter SLE39 und anderen Autoimmunerkrankungen32,33,34,35,36,37,38, was auf eine mögliche Rolle des Mikrobioms im Gleichgewicht zwischen entzündlichen und regulatorischen Reaktionen hindeutet, entweder im Darm oder systemisch. Daher scheint es für die menschliche Gesundheit von entscheidender Bedeutung zu sein, zu verstehen, wie die Darmmikrobiota Immunreaktionen beeinflusst, insbesondere bei chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Autoimmunerkrankungen. Nach unserem besten Wissen ist dies jedoch die erste Studie, die die Wirkung von aus SLE-Stuhlproben isolierten Darmmikrobiota auf die Induktion von Effektor- oder regulatorischen T-Zell-Reaktionen untersucht.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Unterschiede in der Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota zwischen SLE-Patienten und HC unterschiedliche In-vitro-Immunreaktionen hervorriefen. Insbesondere förderten mit SLE-M stimulierte DCs die Th17-Differenzierung von naiven CD4+-T-Lymphozyten stärker als HC-M-konditionierte DCs. Bei der Bildung von Treg-Zellen wurden keine Unterschiede festgestellt, aber die mit der SLE-M-Behandlung erhaltene vergrößerte CD25-Hochpopulation enthielt tendenziell einen geringeren Anteil an Foxp3+-Zellen, was eher deren aktivierten als regulatorischen Status unterstützt. Daher könnte die veränderte SLE-Darmmikrobiota die Lymphozytenaktivierung und Th17-Differenzierung verstärken und so die bereits bestehende Entzündung aufrechterhalten.

Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen der Ex-vivo-Analysen überein, da die Häufigkeit von Th17-Zellen im frischen peripheren Blut von SLE-Patienten im Vergleich zu HC erhöht war, insbesondere bei Patienten mit Anti-dsDNA-Antikörpern, während bei Treg-Zellen keine Unterschiede beobachtet wurden . Interessanterweise wiesen SLE-Patienten einen höheren Anteil an Foxp3+-Zellen auf, die IL-17 produzierten, was auf einen möglichen Treg-Th17-Transdifferenzierungsprozess hindeutet, der für die bei SLE-Patienten berichtete verringerte regulatorische Aktivität von Treg-Zellen verantwortlich sein könnte18. In ähnlicher Weise wurde bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen eine erhöhte Prävalenz zirkulierender IL-17- und Foxp3-doppelt exprimierender CD4+-Lymphozyten zusammen mit einer verringerten Treg-Suppressorfähigkeit festgestellt44. Bemerkenswert ist die im Vergleich zu anderen Organen45 erhöhte Häufigkeit von Treg-Zellen im Darm, sie weisen jedoch eine erhöhte Treg/Th-Plastizität auf, die durch Entzündungsmediatoren, bestimmte Bakterienstämme und andere Mikroumweltfaktoren beeinflusst werden könnte46. Dementsprechend ergaben die Analysen der fäkalen Mikrobiota eine starke negative Korrelation zwischen der Größe der IL-17+ Foxp3+- und in geringerem Maße Th17-Populationen und der Häufigkeit von Firmicutes bei gesunden Kontrollpersonen, was darauf hindeutet, dass sie der Th17-Differenzierung entgegenwirken könnten. Andererseits korrelierten die Serumspiegel von IFNγ, dem prototypischen Th1-Zytokin und bei SLE leicht reduziert, bei Patienten direkt mit der Menge an Firmicutes und dem Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes, wobei dieses Ungleichgewicht das Hauptmerkmal der SLE-Dysbiose und unabhängig von der Krankheit ist Dauer, Lebensstil und ernährungsbedingte Faktoren39. Daher gehen wir davon aus, dass Bakterienstämme, die zum Stamm der Firmicutes gehören, an der Bildung und/oder Aufrechterhaltung funktioneller Treg-Zellen im Darm beteiligt sein könnten, wodurch die Transdifferenzierung in Effektor-Th17-Zellen unter physiologischen Bedingungen vermieden wird, während der Anteil dieser Bakterien verringert ist in pathologischen Situationen kann die Verzerrung von Th17 gegenüber Th1 und Treg fördern und IL-17+ Foxp3+-Zellen erzeugen. Daher könnte die Anreicherung der Darmmikrobiota mit Treg-induzierenden Bakterien ein wünschenswertes Ziel für SLE-Patienten sein. Obwohl das Firmicutes/Bacteroidetes-Verhältnis den Hauptunterschied zwischen gesunden Kontrollpersonen und SLE-Patienten darstellt, konnten die spezifischen Bakteriengruppen, die an der beobachteten Th17-Immunantwort im Zusammenhang mit SLE-Mikrobiota beteiligt sind, mit unserem Ansatz nicht bestimmt werden, insbesondere unter Berücksichtigung der Firmicutes-Phyla sowohl Th1747 als auch Treg23,41,42,43,44 induzierende Bakterien. Daher würde die Bestätigung einer solchen Hypothese von zusätzlichen Experimenten mit keimfreien Mäusen oder fäkalen Mikrobiota-Transplantationsverfahren in Tiermodellen profitieren.

Bestimmte kommensale Mikroorganismen haben die Fähigkeit gezeigt, Treg zu induzieren, und wurden daher als potenzielle probiotische Stämme vorgeschlagen, die zur Modulation einer übermäßigen Entzündungsreaktion geeignet sind, um die Immunhomöostase an der Darmschleimhaut wiederherzustellen. Daher führten wir in dieser Studie In-vitro-Analysen durch, um den möglichen Effekt der Anreicherung der SLE-Darmmikrobiota mit Stämmen zu bestimmen, von denen bekannt ist, dass sie in der Lage sind, naive T-Lymphozyten in Treg-Zellen zu differenzieren. Firmicutes-Stamm enthält mehrere Clostridium-Arten, die zu den Clustern IV und XIVa gehören und bekanntermaßen Treg-Zellen induzieren23,41,42,43. In ähnlicher Weise wurde auch gezeigt, dass Bifidobakterien die Treg-Polarisierung und Th17-Reduktion in vivo mithilfe von Mausmodellen für Kolitis fördern48. Daher verwendeten wir eine Mischung aus zwei dieser Clostridia-Stämme sowie einen Bifidobacterium-Stamm mit zuvor in vitro nachgewiesener Fähigkeit, funktionelle Treg-Zellen zu erzeugen23,24. Unerwarteterweise gelang es keinem von beiden, diese Population zu vergrößern, aber die Ergebnisse zeigten andere positive Wirkungen, die bei jeder Bakterienbehandlung unterschiedlich waren. Die Ergänzung von SLE-M mit Clostridien führte zu einer signifikanten dosisabhängigen Verringerung des IL-17/IFNγ-Gleichgewichts und stellte so den Th1-Bias wieder her, wohingegen die Anreicherung mit Bifidobakterien die Überaktivierung von CD4+-Lymphozyten verhinderte, was durch die Verringerung der CD25-Expression nachgewiesen wurde. Diese Effekte könnten jedoch die Folge einer aktiven Unterdrückung von Effektor-Th-Zellen sein. Tatsächlich kann die beobachtete Herunterregulierung von Th17-Zellen durch eine bevorzugte Förderung von Treg-Zellen durch Clostridienstämme erklärt werden, in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Atarashi et al.43 unter Verwendung keimfreier Mäuse, die mit verschiedenen Fraktionen gesunder menschlicher Mikrobiota besiedelt wurden. Ebenso führt die unterdrückende Funktion von Treg-Zellen, die mit dem hier verwendeten Bifidobacterium-Stamm erzeugt werden, zu einer Herunterregulierung der CD25-Expression auf Effektorzellen23. Angesichts dieser Ergebnisse und der zuvor berichteten SLE-Dysbiose erscheint es daher sinnvoll, den möglichen therapeutischen Nutzen der Ergänzung mit Probiotika, die Treg-Induktor-Stämme enthalten, in Betracht zu ziehen, um das Treg/Th17/Th1-Gleichgewicht bei SLE-Patienten wiederherzustellen.

Ein weiteres bemerkenswertes Ergebnis ist die vermutete Rolle von Synergistetes, einem wenig bekannten Darmbakterium, bei SLE. Diese Bakteriengruppe korrelierte negativ mit Bacteroidetes und positiv mit dem Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes bei gesunden Kontrollpersonen, während bei SLE-Patienten eine starke negative Korrelation mit den bei SLE-Patienten erhöhten Serumspiegeln von IL-6, einem proinflammatorischen und Th17-fördernden Zytokin, gezeigt wurde. Darüber hinaus nahm die Menge an Synergistetes tendenziell ab, wenn der Titer der Anti-dsDNA-Antikörper erhöht wurde, was charakteristisch für SLE ist. Diese Ergebnisse veranlassten uns, die mögliche Rolle von intestinalen Synegisteten bei der Entwicklung schützender humoraler Immunantworten zu bewerten. Natürliche IgM-Antikörper gegen Kommensalbakterien oder Neoantigene aus apoptotischen Zellen sind häufig von Geburt an im menschlichen Blutkreislauf vorhanden und haben schützende und immunregulatorische Funktionen. Unter ihnen sind IgM-Antikörper, die Phosphorylcholin (PC) erkennen, wertvolle Bestandteile des Immunsystems, von denen bekannt ist, dass sie die Phagozytose apoptotischer Zellen erhöhen und Entzündungswege bei Autoimmunität und Arteriosklerose hemmen20,22,49. Allerdings schien Anti-PC-IgG diese Schutzwirkung nicht zu besitzen. Die Ergebnisse unserer SLE-Kohorte zeigten, dass der Anteil von Synergistetes positiv mit dem Gesamt- und Anti-PC-IgM- und IgM/IgG-Verhältnis bei SLE-Patienten korrelierte, wohingegen die Serumspiegel von IL-6 den gegenteiligen Zusammenhang aufwiesen. Diese Daten deuten darauf hin, dass intestinale Synergistetes eine schützende Rolle bei der Bildung natürlicher IgM-Antikörper spielen, was bei SLE-Patienten, insbesondere bei solchen mit hohen IL-6-Spiegeln, beeinträchtigt sein könnte. Interessanterweise wurde berichtet, dass Anti-PC-IgM-Antikörper der IL-6-Hochregulation in vitro und in vivo entgegenwirken können22, wahrscheinlich durch die Hemmung von MAPK-Reaktionen auf TLR-Agonisten, einschließlich Lupus-Immunkomplexe50, was die gegensätzlichen Assoziationen dieser natürlichen Antikörper mit erklärt Synergistetes und IL-6. Darüber hinaus sind bei IL-6-Knockout-Mäusen B1-Zellen und Anti-PC-Antikörper erhöht, während bei B2-Zellen und IgG-Spiegeln das Gegenteil der Fall ist51. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen korrelierte der Anti-dsDNA-Titer negativ mit den Anti-PC-Spiegeln, was auf eine schädliche Auswirkung der Krankheitsaktivität auf die Menge natürlicher schützender Antikörper schließen lässt. Tatsächlich wurden höhere Anti-PC-IgM-Spiegel mit einer geringeren SLE-Krankheitsaktivität in Verbindung gebracht20. Leider wurden aktive Patienten nicht in unsere Studie zur Darmmikrobiota einbezogen, um eine Beeinträchtigung der Behandlungen zu vermeiden, sodass keine signifikanten Zusammenhänge zwischen dem SLEDAI-Score und Synergistetes oder Anti-PC-IgM-Antikörpern festgestellt wurden.

Die Beteiligung von Synergistetes an der Förderung natürlicher Antikörper, insbesondere solcher mit atheroprotektiver Funktion, könnte für Patienten mit SLE und anderen Autoimmunerkrankungen von klinischer Relevanz sein, da sie in der Regel vorzeitige Arteriosklerose entwickeln und ein erhöhtes kardiovaskuläres Risiko haben, das nicht durch klassische Faktoren erklärt werden kann . Es wurde berichtet, dass verringerte Konzentrationen von Anti-PC-IgM-Antikörpern bei SLE-Patienten eine subklinische Herz-Kreislauf-Erkrankung vorhersagen könnten21. Darüber hinaus wiesen Patienten, die ein kardiovaskuläres Ereignis erlitten hatten, im Vergleich zu den übrigen Patienten deutlich geringere Werte dieser Antikörper auf21,49. Tatsächlich wurde eine Therapie, die auf der passiven Übertragung von Anti-PC basiert, eingesetzt, um die Entwicklung von Arteriosklerose zu hemmen52. Daher könnte die Identifizierung von Darmmikroorganismen, die in der Lage sind, natürliche humorale Reaktionen durch die Förderung schützender IgM-Antikörper zu verstärken, wie beispielsweise Synergistetes, wertvolle Instrumente für die Gestaltung klinischer Interventionen sein, um sowohl die Krankheitsaktivität als auch die Prävention kardiovaskulärer Komplikationen zu verbessern. In diesem Sinne dürfte die Analyse fäkaler Synergisteten bei SLE-Patienten mit und ohne kardiovaskuläre Ereignisse von Interesse sein.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere In-vitro-Kulturen mit aus SLE-Patienten isolierten fäkalen Mikrobiota darauf hindeuten, dass Immunreaktionen gegen Darmbakterien an der Überaktivierung der Lymphozyten sowie an der bei SLE-Patienten beobachteten Treg-Th17-Transdifferenzierung mit reduzierten Firmicutes beteiligt sein könnten Das Verhältnis von Bacteroidetes zu Bacteroidetes dürfte bei diesem Prozess eine Rolle gespielt haben. Die veränderten Immunantworten, die mit der Darmdysbiose einhergehen, könnten zumindest teilweise durch die Ergänzung mit nützlichen Bakterienstämmen wiederhergestellt werden, die in der Lage sind, Suppressorreaktionen auszulösen. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse eine mögliche Rolle von intestinalen Synergistetes bei der Entwicklung natürlicher schützender Anti-PC-IgM-Antikörper. Dies könnte für Patienten mit hohen IL-6- und/oder Anti-dsDNA-Spiegeln von besonderer Bedeutung sein, da diese Bakterien nur selten vorkommen.

Die Ethikgenehmigung für diese Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki vom Bioethikausschuss des CSIC (Consejo Superior de Investigaciones Científicas) und vom regionalen Ethikausschuss für klinische Forschung (Servicio de Salud del Principado de Asturias) eingeholt. Alle Methoden wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt und vor der Teilnahme an der Studie wurde von allen Teilnehmern eine unterzeichnete schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden aus Standard-Buffy-Coat-Präparaten von 7 gesunden Blutspendern (Asturian Blood Transfusion Center, Oviedo, Spanien) durch Zentrifugation über Ficoll-Hypaque-Gradienten (Lymphoprep, Nycomed, Oslo, Norwegen) gewonnen. Monozyten (CD14+ ≥ 95 %) wurden aus zuvor erhaltenen PBMCs durch negative Selektion unter Verwendung des Human Monozyten-Anreicherungskits (EasySep, Stem Cell Technologies, Kanada) isoliert.

Unreife DCs wurden durch Standardverfahren aus isolierten Monozyten gewonnen. Daher wurden Monozyten in Platten mit 24 Vertiefungen bei 5 × 105 Zellen/ml 7 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 in vollständigem RPMI-Medium (RPMIc) [RPMI 1640 mit 2 mML Glutamin und 25 mM Hepes (Bio Whitaker, Verviers, Belgien), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) und den Antibiotika Streptomycin und Ampicillin zu 100 mg/ml] in Gegenwart von rekombinantem humanem (rh) IL-4 (35 ng/ml) und rhGM -CSF (70 ng/ml) (R&D Systems, Abingdon, UK). An den Tagen 2 und 5 wurden 0,5 ml des Mediums entfernt, ohne die Cluster der sich entwickelnden DC zu stören, und 0,5 ml frisch hergestelltes GM-CSF- und IL-4-haltiges Medium wurden in die Vertiefungen gegeben, wodurch das Endvolumen in jeder Vertiefung wiederhergestellt wurde bis 1 ml. Am Tag 7 wurden unreife DCs gewonnen, gewaschen und zur anschließenden Reifung in RPMIc-Medium bei 5 × 105 Zellen/ml resuspendiert.

Unreife, von Monozyten abgeleitete DCs wurden in RPMIc-Medium mit 1 mg/ml LPS aus E. coli 0111:B4 (Sigma, St. Louis, MO) als positive Kontrolle der Reifung oder mit verschiedenen Bakterienpräparaten bei einem DC:Bakterium kultiviert Verhältnis 1:10. Zu diesem Zweck wurde eine gepoolte fäkale Mikrobiota (M), die entweder aus vier gesunden Kontrollpersonen (HC-M) oder fünf SLE-Patienten (SLE-M) isoliert wurde und zuvor durch Metagenomikstudien39 als repräsentativ für beide Erkrankungen erwiesen wurde, hergestellt und in DC verwendet Kulturen. Außerdem wurden SLE-M mit unterschiedlichen Anteilen von Bifidobacterium bifidum LMG13195 (Bb), einem Stamm, der bekanntermaßen die Foxp3-Expression induziert23,41, oder mit einer Mischung aus zwei Clostridia-Stämmen (Cl: Ruminococcus obeum DSM25238 und Blautia coccoides DSM935, Verhältnis 1: 1), die einen mutmaßlichen Treg-induzierenden Effekt haben42,43. Daher wurden 5, 10 oder 15 % SLE-M durch die gleichen Anteile an Bb oder Cl ersetzt und zur DC-Stimulation verwendet. Als Kontrollen wurden Kulturen mit Bb- und Cl-Bakterienpräparaten durchgeführt. Nach 48 Stunden wurden DCs aus den 11 verschiedenen Behandlungen geerntet, der reife Phänotyp getestet und zur Stimulierung naiver CD4+ T-Zellen verwendet.

CD4+-T-Zellen wurden aus PBMCs durch negative Selektion unter Verwendung des Human CD4+ T Cell Enrichment Kit (EasySep) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert, und dann wurden naive CD45RA+-T-Zellen nach Erschöpfung der CD45RO+-Zellen abgetrennt (Miltenyi Biotec, Deutschland). Von Monozyten abgeleitete DCs, die mit LPS oder mit den verschiedenen Bakterienpräparaten gereift waren, wurden mit gereinigten CD4+ CD45RA+ T-Zellen in 48-Well-Platten bei einem DC:T-Zell-Verhältnis von 1:10 kokultiviert. Am 5. und 8. Tag wurden die mit allen Behandlungen inkubierten Zellen mit IL-2 (30 U) expandiert. Nach 12 Tagen wurden die Zellen gesammelt und zweimal gewaschen, bevor der Treg/Th17/Th1-Phänotyp mittels Durchflusszytometrie analysiert wurde.

Bifidobacterium bifidum LMG13195 wurde in MRS-Brühe (Difco, Detroit, MI) gezüchtet, ergänzt mit 0,05 % (Gew./Vol.) L-Cystein (Sigma). Ruminococcus obeum DSM25238 und Blautia coccoides DSM935 wurden in einer Kombination aus verstärkter Clostridienbrühe (Merck, Darmstadt, Deutschland) und Gehirn-Herz-Infusion (Difco), ergänzt mit 5 % (v/v) hitzeinaktiviertem FCS (LabClinics, Barcelona, ​​Deutschland) kultiviert. Spanien). Die Kulturen wurden bei 37 °C in einer anaeroben MG500-Kammer (Don Whitley Scientific, West Yorkshire, UK) mit einer Atmosphäre aus 10 % (v/v) H2, 10 % CO2 und 80 % N2 gezüchtet. Die Kulturen wurden durch Zentrifugation geerntet, dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und im gleichen Puffer auf eine Konzentration von 108 Bakterien/ml resuspendiert. Die Bakterien wurden mit einer Thoma-Zellzählkammer (Marienfeld Superior, Deutschland) gezählt. Bakterienzellen wurden abgetötet, indem sie in einer UV-Kammer (15 W, Selecta, Barcelona, ​​Spanien) drei aufeinanderfolgenden Zyklen von jeweils 30 Minuten Strahlung ausgesetzt wurden. Nach der UV-Behandlung wurde eine Plattenzählung durchgeführt, um das Fehlen von Bakterien zu bestätigen, die sich im richtigen Medium erholen konnten. UV-abgetötete Bakteriensuspensionen wurden in Aliquots verteilt und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Identität der Stämme wurde durch Sequenzierung der variablen Regionen V1 und V2 des 16 S-rRNA-Gens unter Verwendung der Primer plb16 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) und mlb16 (5′-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3′)53 bestätigt.

Ein Teil der Stuhlprobe von 4 gesunden Kontrollpersonen und 5 SLE-Patienten, die zuvor in einer metagenomischen Studie39 verwendet wurde, wurde einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen, um die Mikrobiota vom Rest des Stuhlmaterials gemäß der Methode von Courtois et al.54 zu trennen . Der Kot wurde in sterilem NaCl 0,9 % (1:9; w/v) 1 Minute lang in einem Homogenisator (Stomacher Lab Blender 400, WVR, Barcelona, ​​Spanien) homogenisiert. Eine Lösung von Nycodenz® 80 % (Gew./Vol.) (PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, DE) wurde in Reinstwasser hergestellt und 15 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert. Ein Volumen von 10,5 ml der homogenisierten Stuhlproben wurde auf 3,5 ml der Nycodenz®-Lösung gegeben und 40 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 g zentrifugiert. Die obere Phase, die lösliche Trümmer enthielt, wurde verworfen und die den Mikrobiota entsprechenden Schichten wurden 5 Minuten lang in Eis gehalten, um die Ausfällung unlöslicher Trümmer zu ermöglichen, zweimal in PBS gewaschen und in Aliquots von im gleichen Puffer gelagert 1 ml 108 Mikroorganismen/ml bei −80 °C. UV-inaktivierte Mikrobiota wurden wie im vorherigen Abschnitt beschrieben erhalten.

Siebenunddreißig SLE-Patienten, die mindestens vier überarbeitete Kriterien des American College of Rheumatology (ACR) für die Klassifizierung von SLE55 erfüllten, wurden aus dem aktualisierten asturischen Lupus-Register56,57 ausgewählt. Informationen zu klinischen Merkmalen während des Krankheitsverlaufs wurden durch Überprüfung der klinischen Vorgeschichte erhalten (Tabelle 1). Als Kontrollen dienten 36 geschlechts- und altersgleiche gesunde Blutspender (Durchschnittsalter ± SD: 42,56 Jahre ± 11,39). Zum Zeitpunkt der Probenahme: Anti-dsDNA-Titer, SLE-Krankheitsaktivitätsindex (SLEDAI) und/oder Gewicht, BMI (Body-Mass-Index) und Blutfette [Triglyceride, HDL (High-Density-Lipoprotein), LDL (Low-Density-Lipoproteine) und Gesamtcholesterin] wurden ausgewertet und den Patienten wurden genaue Fragen zu der Behandlung gestellt, die sie in den letzten 6 Monaten erhalten hatten.

Eine metagenomische Analyse der fäkalen Mikrobiota wurde bei 20 nicht aktiven SLE-Patienten ohne Antibiotika- oder immunsuppressive Behandlung in den letzten 6 Monaten und bei 20 altersentsprechenden gesunden Kontrollpersonen durchgeführt, wie zuvor beschrieben39. Über die fäkale DNA-Extraktion, die 16 S-rRNA-Amplifikationssequenzierung von 16 S-rRNA-Gen-basierten Amplifikaten und die sequenzbasierte Mikrobiota-Analyse wurde an anderer Stelle berichtet39. Die in diesem Artikel berichteten Rohsequenzen sind im NCBI Short Read Archive (SRA) hinterlegt (Studienzugangsnummer: SRP028162).

Phänotypische Studien an kultivierten Zellen und Blutproben wurden nach Färbung mit dem entsprechenden monoklonalen Antikörper (mAb) durchgeführt. Die Reifung kultivierter DCs wurde nach 30-minütiger Färbung bei 4 °C mit Anti-CD86-Fluoresceinisothiocyanat (FITC), -CD80-Phycoerythrin (PE), -HLA-DR PE-Cy5, -CD1a-FITC-mAb oder mit dem entsprechenden Isotyp verifiziert passender konjugierter irrelevanter mAb als Negativkontrolle (alle mAb wurden von Pharmingen geliefert). Um den Treg/Th17/Th1-Phänotyp sowohl in kultivierten Zellen als auch in Blutproben zu bestimmen [zuvor 5 Minuten lang mit 2 ml BD Lysing Solution (BD Biosciences, San Diego, CA) lysiert und zweimal mit PBS gewaschen], wurden CD4+-Lymphozyten zunächst extrazellulär mit gefärbt Anti-CD4-Allophycocyanin-Cy7 (APC-Cy7), Anti-CD25-FITC und Anti-CD127-PE-Cy7mAb oder mit dem entsprechenden Isotyp-angepassten konjugierten irrelevanten mAb (alle von eBiosciences, San Diego, CA). Anschließend wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und intrazellulär mit Anti-FOXP3 PE, IFNγ PerCP-Cy5.5 und IL-17 A APC (Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffersatz; eBiosciences) oder mit dem entsprechenden Isotyp-angepassten konjugierten irrelevanten mAb gefärbt. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Mindestens 10.000 CD4+-Lymphozyten wurden mit einem FACSCanto II-Durchflusszytometer (BD) erfasst und mit der FlowJo-Software (Tree Star Inc.) analysiert. Die spezifische Fluoreszenzintensität wurde als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) quantifiziert, die durch Subtrahieren des Hintergrunds der Isotyp-angepassten Kontrollfärbung von der Gesamtfluoreszenz berechnet wurde.

Serumproben von SLE-Patienten und HC wurden gesammelt und bei –80 °C gehalten, bis die Zytokinbestimmung durchgeführt wurde. Die Mengen an IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-17 A, IFNα, VEGF und GM-CSF wurden mit dem Cytmetric Bead Arrays Flex Set unter Verwendung eines FACS Canto II analysiert Durchflusszytometer (BD Biosciences). Für IL-1β, IL-6, IL-10 und IL-12p70 war ein Enhanced Sensitivity Flex Set erforderlich. ELISA-Kits wurden zur Quantifizierung von TNFα, Leptin, Resistin (Mini EDK-Kit, PeproTech), BLyS (Human BAFF Instant ELISA, eBioscience) und IFNγ (OptEIA-Kit, BD) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die unteren Nachweisgrenzen lagen bei 48,4 fg/ml für IL-1β, 1,4 pg/ml für IL-4, 68,4 fg/ml für IL-6, 1,2 pg/ml für IL-8 und 13,7 fg/ml für IL-10 , 12,6 fg/ml für IL-12p70, 0,3 pg/ml für IL-17 A, 1,25 pg/ml für IFNα, 4,5 pg/ml für VEGF, 0,2 pg/ml für GM-CSF, 3,9 pg/ml für TNFα, 63 pg/ml für Leptin, 24 pg/ml für Resistin, 130 pg/ml für BLyS und 0,58 pg/ml für IFNγ.

IgG- und IgM-Antikörper gegen Phosphorylcholin (Anti-PC) wurden in Serumproben von Patienten und Kontrollpersonen durch einen hauseigenen ELISA-Test wie folgt quantifiziert. Mikrotitervertiefungen (Maxisorp, Nunc) wurden über Nacht mit an Rinderserumalbumin (PC-BSA) konjugiertes Phosphorylcholin (Biosearch Technologies, Petaluma) beschichtet und 2 Stunden lang bei 37 °C mit PBS 2 % BSA blockiert. Als Anti-PC-Ab-Standard wurde ein Serumpool gesunder Kontrollpersonen verwendet. Serumproben und Anti-PC-Standard wurden in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) verdünnt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach dem Waschen mit TBS/Tween 20 (0,05 %) wurden die Vertiefungen 2 Stunden lang bei RT mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Anti-Human-IgG oder IgM (Immunostep, Salamanca, Spanien) inkubiert. Abschließend wurden die Platten zweimal gewaschen und unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Substrat freigelegt. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt. Die Mengen an willkürlichen Serum-Anti-PC-Einheiten wurden für jede Probe gemäß den Standardkurven berechnet. In ähnlicher Weise wurden Gesamt-IgG oder IgM durch herkömmliche ELISA-Techniken quantifiziert.

Zur Beurteilung der Normalverteilung der Daten wurde der Kolmogorov-Smirnov-Test verwendet. Die Daten der In-vitro-Experimente wurden durch den Mittelwert ± SEM dargestellt und die Unterschiede zwischen den Kulturbedingungen wurden durch den gepaarten Wilcoxon-Test bewertet. Die Zytokinserumspiegel von SLE-Patienten und gesunden Kontrollpersonen wurden als Medianwert (Interquartilbereich) ausgedrückt und der nichtparametrische Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um Unterschiede zwischen beiden Gruppen zu bestimmen. Die Prozentsätze der Treg/Th1/Th17-Zellen wurden mithilfe des Kruskal-Wallis-Tests verglichen; Wenn ein signifikanter Test erzielt wurde, wurden Dunns Post-hoc-Tests durchgeführt, um statistische Unterschiede in Gruppenpaaren zu bestimmen. Assoziationen der Häufigkeit fäkaler Mikrobengruppen mit T-Zell-Untergruppen, Zytokin-Serumspiegeln und Autoantikörpern wurden durch Spearmans Rangkorrelationstest untersucht und durch multivariate lineare Regressionsanalysen bestätigt, angepasst an Gewicht, BMI und Blutfette (Triglyceride, HDL, LDL und Gesamtcholesterin). GraphPad Für alle Bestimmungen wurden die Software Prism 5 (GraphPad Software, USA) und das Statistiksoftwarepaket SPSS 22 (SPSS Inc.) verwendet, und ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Zitierweise für diesen Artikel: Lopez, P. et al. Th17-Reaktionen und natürliche IgM-Antikörper hängen mit der Zusammensetzung der Darmmikrobiota bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes zusammen. Wissenschaft. Rep. 6, 24072; doi: 10.1038/srep24072 (2016).

SRP028162

Rahman, A. & Isenberg, DA Systemischer Lupus erythematodes. N. engl. J. Med. 358, 929–939 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Sanz, I. & Lee, FE-H. B-Zellen als therapeutische Ziele bei SLE. Nat. Rev. Rheumatol. 6, 326–337 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Zhu, J. & Paul, WE CD4+ T-Zellen: Schicksale, Funktionen und Fehler. Blut 112, 1557–1569 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Alunno, A. et al. Gleichgewicht zwischen regulatorischen T- und Th17-Zellen bei systemischem Lupus erythematodes: Das Alte und das Neue. J. Immunol. Res. 2012, e823085 (2012).

Google Scholar

Ma, J. et al. Das Ungleichgewicht zwischen regulatorischen und IL-17-sekretierenden CD4+ T-Zellen bei Lupus-Patienten. Klin. Rheumatol. 29, 1251–1258 (2010).

Artikel Google Scholar

Talaat, RM, Mohamed, SF, Bassyouni, IH & Raouf, AA Th1/Th2/Th17/Treg-Zytokin-Ungleichgewicht bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE): Korrelation mit der Krankheitsaktivität. Cytokine 72, 146–153 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Pan, H.-F. et al. Expressionsprofile von Genen, die mit dem Th17-Signalweg in Zusammenhang stehen, bei systemischem Lupus erythematodes beim Menschen. Mol. Biol. Rep. 40, 391–399 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Qu, N. et al. Zentrale Rollen der T-Helfer-17-verwandten Zytokine IL-17, IL-22 und IL-23 bei entzündlichen Erkrankungen. J. Immunol. Res. 2013, e968549 (2013).

Google Scholar

Chen, XQ et al. Plasma-IL-17A ist bei Patienten mit neuem SLE erhöht und mit Krankheitsaktivität verbunden. J. Clin. Immunol. 30, 221–225 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Crispín, JC et al. Erweiterte doppelt negative T-Zellen bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes produzieren IL-17 und infiltrieren die Nieren. J. Immunol. Baltim. Md 1950 181, 8761–8766 (2008).

Google Scholar

Doreau, A. et al. Interleukin 17 wirkt in Synergie mit dem B-Zell-aktivierenden Faktor, um die B-Zell-Biologie und die Pathophysiologie des systemischen Lupus erythematodes zu beeinflussen. Nat. Immunol. 10, 778–785 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, Y. et al. Lasermikrodissektionsbasierte Analyse des Zytokingleichgewichts in den Nieren von Patienten mit Lupusnephritis. Klin. Exp. Immunol. 159, 1–10 (2010).

Artikel Google Scholar

Shevach, EM Mechanismen der regulatorischen zellvermittelten Unterdrückung von foxp3+ T. Immunität 30, 636–645 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Fontenot, JD, Gavin, MA & Rudensky, AY Foxp3 programmiert die Entwicklung und Funktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen. Nat. Immunol. 4, 330–336 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Feuerer, M., Hill, JA, Mathis, D. & Benoist, C. Foxp3+ regulatorische T-Zellen: Differenzierung, Spezifikation, Subphänotypen. Nat. Immunol. 10, 689–695 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Lyssuk, EY, Torgashina, AV, Soloviev, SK, Nassonov, EL & Bykovskaia, SN Reduzierte Anzahl und Funktion von CD4+CD25highFoxP3+ regulatorischen T-Zellen bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes. Adv. Exp. Med. Biol. 601, 113–119 (2007).

Artikel Google Scholar

Valencia, J. Immunol. 178, 2579–2588 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Gomez, J., Prado, C., Lopez, P., Suárez, A. & Gutiérrez, C. Konservierte antiproliferative Wirkung und schlechte Hemmung der TNFalpha-Sekretion durch regulatorische CD4+CD25+ T-Zellen bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes. Klin. Immunol. Orlando Fla 132, 385–392.

Artikel Google Scholar

Round, JL & Mazmanian, SK Die Darmmikrobiota prägt die Immunantwort des Darms bei Gesundheit und Krankheit. Nat. Rev. Immunol. 9, 313–323 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Grönwall, C. & Silverman, GJ Natürliches IgM: nützliche Autoantikörper zur Kontrolle von Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen. J. Clin. Immunol. 34 Ergänzung 1, S12–21 (2014).

Artikel Google Scholar

Grönwall, C. et al. Zusammenhang zwischen Karotisplaque und natürlichen IgM-Antikörpern bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes. Klin. Immunol. 153, 1–7 (2014).

Artikel Google Scholar

Chen, Y., Park, Y.-B., Patel, E. & Silverman, GJ IgM-Antikörper gegen Apoptose-assoziierte Determinanten rekrutieren C1q und verstärken die Phagozytose dendritischer Zellen apoptotischer Zellen. J. Immunol. 182, 6031–6043 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Lopez, P., Gonzalez-Rodriguez, I., Gueimonde, M., Margolles, A. & Suárez, A. Die Immunantwort auf Bifidobacterium bifidum-Stämme unterstützt die Treg/Th17-Plastizität. PloS One 6, e24776 (2011).

Artikel ADS Google Scholar

López, P., Gueimonde, M., Margolles, A. & Suárez, A. Verschiedene Bifidobacterium-Stämme lösen in vitro unterschiedliche Immunreaktionen aus. Int. J. Lebensmittelmikrobiol. 138, 157–165 (2010).

Artikel Google Scholar

Rescigno, M. et al. Dendritische Zellen exprimieren Tight-Junction-Proteine ​​und dringen in Darmepithel-Monoschichten ein, um Bakterien zu entnehmen. Nat. Immunol. 2, 361–367 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Joffre, O., Nolte, MA & Spörri, R. & Reis und Sousa, C. Entzündungssignale bei der Aktivierung dendritischer Zellen und der Induktion der adaptiven Immunität. Immunol. Rev. 227, 234–247 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Mazmanian, SK, Round, JL & Kasper, DL Ein mikrobieller Symbiosefaktor verhindert entzündliche Darmerkrankungen. Natur 453, 620–625 (2008).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Ivanov, II et al. Spezifische Mikrobiota steuern die Differenzierung von IL-17-produzierenden T-Helferzellen in der Schleimhaut des Dünndarms. Cell Host Microbe 4, 337–349 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Gaboriau-Routhiau, V. et al. Die Schlüsselrolle segmentierter filamentöser Bakterien bei der koordinierten Reifung der Darm-Helfer-T-Zell-Reaktionen. Immunität 31, 677–689 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Yurkovetskiy, L. et al. Die geschlechtsspezifische Voreingenommenheit bei der Autoimmunität wird durch die Mikrobiota beeinflusst. Immunität 39, 400–412 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Markle, JGM et al. Geschlechtsunterschiede im Darmmikrobiom steuern die hormonabhängige Regulation der Autoimmunität. Wissenschaft 339, 1084–1088 (2013).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Garrett, WS et al. Enterobacteriaceae wirken zusammen mit der Darmmikrobiota, um eine spontane und maternal übertragene Kolitis auszulösen. Cell Host Microbe 8, 292–300 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Frank, DN et al. Molekular-phylogenetische Charakterisierung von Ungleichgewichten der mikrobiellen Gemeinschaft bei menschlichen entzündlichen Darmerkrankungen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 104, 13780–13785 (2007).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Yeoh, N., Burton, JP, Suppiah, P., Reid, G. & Stebbings, S. Die Rolle des Mikrobioms bei rheumatischen Erkrankungen. Curr. Rheumatol. Rep. 15, 314 (2013).

Artikel Google Scholar

Wen, L. et al. Angeborene Immunität und Darmmikrobiota bei der Entwicklung von Typ-1-Diabetes. Natur 455, 1109–1113 (2008).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Lee, YK, Menezes, JS, Umesaki, Y. & Mazmanian, SK Proinflammatorische T-Zell-Reaktionen auf Darmmikrobiota fördern experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 108, 4615–4622 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Larsen, N. et al. Die Darmmikrobiota bei menschlichen Erwachsenen mit Typ-2-Diabetes unterscheidet sich von der bei nicht-diabetischen Erwachsenen. PLoS ONE 5, e9085 (2010).

Artikel ADS Google Scholar

Man, SM, Kaakoush, NO & Mitchell, HM Die Rolle von Bakterien und Mustererkennungsrezeptoren bei Morbus Crohn. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 8, 152–168 (2011).

Artikel Google Scholar

Hevia, A. et al. Darmdysbiose im Zusammenhang mit systemischem Lupus erythematodes. mBio 5, e01548–01514 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Turnbaugh, PJ et al. Ein mit Fettleibigkeit assoziiertes Darmmikrobiom mit erhöhter Kapazität zur Energiegewinnung. Natur 444, 1027–1031 (2006).

Artikel ADS Google Scholar

López, P. et al. Die Interaktion von Bifidobacterium bifidum LMG13195 mit HT29-Zellen beeinflusst die Expression regulatorischer T-Zell-assoziierter Chemokinrezeptoren. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 78, 2850–2857 (2012).

Artikel Google Scholar

Atarashi, K. et al. Induktion kolonischer regulatorischer T-Zellen durch indigene Clostridium-Arten. Wissenschaft 331, 337–341 (2011).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Atarashi, K. et al. Treg-Induktion durch eine rational ausgewählte Mischung von Clostridia-Stämmen aus der menschlichen Mikrobiota. Nature 500, 232–236 (2013).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Ueno, A. et al. Eine erhöhte Prävalenz zirkulierender neuartiger IL-17-sekretierender Foxp3-exprimierender CD4+-T-Zellen und eine fehlerhafte Unterdrückungsfunktion zirkulierender Foxp3+-regulatorischer Zellen unterstützen die Plastizität zwischen Th17 und regulatorischen T-Zellen bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen. Entzündung. Darm Dis. 19, 2522–2534 (2013).

Artikel Google Scholar

Hall, JA et al. Kommensale DNA begrenzt die regulatorische T-Zell-Umwandlung und ist ein natürliches Adjuvans für intestinale Immunantworten. Immunität 29, 637–649 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Murai, M., Krause, P., Cheroutre, H. & Kronenberg, M. Regulatorische T-Zell-Stabilität und Plastizität in mukosalen und systemischen Immunsystemen. Schleimhautimmunol. 3, 443–449 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Farkas, AM et al. Induktion von Th17-Zellen durch segmentierte filamentöse Bakterien im Darm der Maus. J. Immunol. Methoden 421, 104–111 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Zheng, B. et al. Bifidobacterium breve mildert die durch Dextrannatriumsulfat induzierte Kolitis bei Mäusen und erhöht die regulatorischen T-Zell-Reaktionen. PloS One 9, e95441 (2014).

Artikel ADS Google Scholar

Grönwall, C. et al. MAPK-Phosphatase-1 ist für die regulatorische, durch natürliche Autoantikörper vermittelte Hemmung von TLR-Reaktionen erforderlich. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 109, 19745–19750 (2012).

Artikel ADS Google Scholar

Bao, S., Husband, AJ & Beagley, KW B1-B-Zellzahlen und Antikörper gegen Phosphorylcholin und LPS sind bei IL-6-Gen-Knockout-Mäusen erhöht. Zelle. Immunol. 198, 139–142 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Su, J. et al. Natürliche Antikörper gegen Phosphorylcholin als potenzielle Schutzfaktoren bei SLE. Rheumatology 47, 1144–1150 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Faria-Neto, JR et al. Passive Immunisierung mit monoklonalen IgM-Antikörpern gegen Phosphorylcholin reduziert die beschleunigte Venentransplantat-Atherosklerose bei Apolipoprotein-E-Null-Mäusen. Atherosclerosis 189, 83–90 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Milani, C. et al. Bewertung der fäkalen Mikrobiota: Ein optimiertes genbasiertes Analyseprotokoll für Ion Torrent 16S rRNA. PLoS ONE 8, e68739 (2013).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Courtois, S. et al. Quantifizierung bakterieller Untergruppen im Boden: Vergleich von DNA, die direkt aus dem Boden oder aus zuvor durch Dichtegradientenzentrifugation freigesetzten Zellen extrahiert wurde. Umgebung. Mikrobiol. 3, 431–439 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Arnett, FC et al. Die American Rheumatism Association überarbeitete 1987 die Kriterien für die Klassifizierung rheumatoider Arthritis. Arthritis Rheum. 31, 315–324 (1988).

Artikel CAS Google Scholar

Gómez, J. et al. Systemischer Lupus erythematodes in Asturien, Spanien: klinische und serologische Merkmale. Medizin (Baltimore) 85, 157–168 (2006).

Artikel Google Scholar

López, P., Mozo, L., Gutiérrez, C. & Suárez, A. Epidemiologie des systemischen Lupus erythematodes in einer nordspanischen Bevölkerung: Einfluss von Geschlecht und Alter auf immunologische Merkmale. Lupus 12, 860–865 (2003).

Artikel Google Scholar

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Diese Arbeit wurde durch FEDER-Mittel der Europäischen Union, Fondo de Investigación Sanitaria (PI12/00523), den spanischen Nationalen Forschungs- und Entwicklungsplan (AGL2010-14952 und AGL2013-44039-R) und die Stiftung zur Förderung angewandter wissenschaftlicher Forschung in Asturien und Technologie (EQUIP09) unterstützt -19). JR-C. ist Empfänger eines FPU-Stipendiums des spanischen Ministeriums für Bildung, Kultur und Sport. BJ und AH sind Empfänger eines Ramón y Cajal-Postdoktorandenvertrags bzw. eines FPI-Stipendiums, beide vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit. Wir danken SLE-Patienten und ALAS (Asociación Lúpicos de Asturias) für ihre kontinuierliche Unterstützung.

Abteilung für funktionelle Biologie, Bereich Immunologie, Medizinische Fakultät, Universität Oviedo, Oviedo, Asturien, Spanien

Patricia Lopez, Banes of Peace, Javier Rodriguez-Carrio und Ana Suarez

Abteilung für Mikrobiologie und Biochemie von Milchprodukten, Institut für Milchprodukte von Asturien (IPLA), Oberster Rat für wissenschaftliche Forschung (CSIC), Villaviciosa, Asturien, Spanien

Banesa of Peace, Heavy Spider, Borja Sanchez & Abelardo Margolles

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PL beteiligte sich an der Studiendurchführung, der Probenentnahme, der Überprüfung der klinischen Manifestationen, der Krankheitsaktivität und Therapie der Patienten, den experimentellen Verfahren, der Datenanalyse/-interpretation und der Manuskripterstellung. BP und JR-C. führte einige experimentelle Verfahren und Datenanalysen durch. BS, AH und AM beteiligten sich an Designstudien, Experimenten und Analysen im Zusammenhang mit Mikrobiota. AS trug zur Studiengestaltung/-durchführung, Dateninterpretation und Manuskripterstellung bei.

Korrespondenz mit Abelardo Margolles.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lopez, P., de Peace, B., Rodriguez-Carrio, J. et al. Th17-Reaktionen und natürliche IgM-Antikörper hängen mit der Zusammensetzung der Darmmikrobiota bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes zusammen. Sci Rep 6, 24072 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24072

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Eingegangen: 14. September 2015

Angenommen: 18. März 2016

Veröffentlicht: 5. April 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24072

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