Auranofin

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 19525 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Mit Medikamenten beladene Nanopartikel (NPs) können die Behandlung von Infektionen verbessern, indem sie die Medikamentenkonzentration an der richtigen Stelle innerhalb des therapeutischen Fensters sicherstellen. Poly(milch-co-glykolsäure) (PLGA)-NPs sind in der Lage, die Arzneimittellokalisierung an der Zielstelle zu verbessern und das eingeschlossene Molekül nachhaltig freizusetzen, wodurch die durch die systemische Antibiotikagabe verursachten Nebenwirkungen reduziert werden. Wir haben Auranofin, eine Goldverbindung, die traditionell zur Behandlung rheumatoider Arthritis verwendet wird, in PLGA-NPs geladen und ihre Wirksamkeit als antibakterielles Mittel gegen zwei grampositive Krankheitserreger, Streptococcus pneumoniae und Streptococcus pyogenes, bewertet. Auranofin-PLGA-NPs zeigten eine starke bakterizide Wirkung, da Kulturen multiresistenter Pneumokokkenstämme nach 6-stündiger Behandlung mit solchen Auranofin-NPs bei 0,25 μM praktisch sterilisiert wurden. Darüber hinaus wurde diese starke bakterizide Wirkung auch in S. pneumoniae- und S. pyogenes-Biofilmen beobachtet, wo die gleiche Konzentration an Auranofin-NPs die Bakterienpopulation um etwa 4 Logarithmen mehr verringern konnte als freies Auranofin. Diese Ergebnisse wurden anhand eines Zebrafischembryo-Modells validiert und zeigten, dass die Behandlung mit in NPs geladenem Auranofin ein spürbares Überleben gegen Pneumokokkeninfektionen erzielte. Alle diese Ansätze zeigten eine klare Überlegenheit der beladenen Auranofin-PLGA-Nanoträger im Vergleich zur freien Verabreichung des Arzneimittels, was ihre mögliche Anwendung zur Behandlung von Streptokokkeninfektionen unterstützt.

Bakterielle Infektionen sind für eine erhebliche Morbidität und Mortalität im klinischen Umfeld verantwortlich und stellen eine globale Gesundheitsbedrohung und eine Belastung für die Gesundheitssysteme dar1. Streptococcus pneumoniae, der Pneumokokkus, ist ein grampositiver Erreger und eine der Hauptursachen für Krankheiten wie Mittelohrentzündung, Bakteriämie und Meningitis bei kleinen Kindern, älteren Menschen und Personen mit chronischen Erkrankungen. Die klinische Belastung beträgt etwa 2 Millionen Todesfälle pro Jahr aufgrund einer invasiven Erkrankung (definiert als Isolierung von S. pneumoniae aus einer normalerweise sterilen Stelle wie Blut oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit), die Hälfte davon betrifft Kinder unter 5 Jahren, ist jedoch wahrscheinlich viele weitere aufgrund nicht-bakteriämischer Lungenentzündung und anderer Atemwegserkrankungen2. Schätzungen zufolge gibt es daher auf jeden Fall einer bakteriämischen Pneumokokken-Pneumonie bei Erwachsenen mindestens drei weitere Fälle einer nicht-bakteriämischen Pneumokokken-Pneumonie3. Die klassische Behandlung zur Bekämpfung von Pneumokokken-Infektionen war der Einsatz von Antibiotika. Die Wirksamkeit dieser Therapie wurde jedoch durch die fortschreitende Selektion aufgrund von Resistenzen gegen wichtige Arzneimittelklassen beeinträchtigt, und es wird häufig über Behandlungsversagen berichtet4,5. Darüber hinaus ist eine kleinere, aber wachsende Zahl von Pneumokokken-Isolaten gegen mehrere Antibiotika resistent, so dass Vancomycin das Medikament der letzten Wahl ist6. Streptococcus pyogenes ist auch ein wichtiger menschlicher Krankheitserreger, da er das am häufigsten bei Patienten mit Pharyngitis isolierte Bakterium ist, obwohl es schwerwiegendere invasive Infektionen verursacht, darunter nekrotisierende Fasziitis, Sepsis und toxisches Schocksyndrom. Bei Streptokokken-Pharyngitis wurde über Misserfolge bei der Antibiotikabehandlung berichtet, die hauptsächlich auf die Bildung von Biofilmen zurückzuführen sind7. Daher haben die US-amerikanischen Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten (CDC) in einem aktuellen Bericht aggressive und sofortige Maßnahmen gefordert, um die Ausbreitung arzneimittelresistenter Krankheitserreger zu stoppen8.

Es ist allgemein bekannt, dass die Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln heutzutage ein sehr teurer, zeitaufwändiger und riskanter Prozess ist. Das sogenannte „Repurposing“ (oder „Reprofiling“) von Arzneimitteln ist eine alternative und vielversprechende Strategie zur Beschleunigung dieses Arzneimittelentwicklungsprozesses bei gleichzeitiger Reduzierung der Ausfallraten und der damit verbundenen Kosten9,10. In diesem Sinne handelt es sich bei Auranofin um eine Goldverbindung mit gemischten Liganden, die 1985 von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassen, unter dem Markennamen Ridaura vermarktet und zur Behandlung schwerer rheumatoider Arthritis empfohlen wird11. Vor einigen Jahren wurden neue attraktive pharmazeutische Aktivitäten für Auranofin bekannt gegeben, darunter krebshemmende, antivirale und gegen pathogene Protozoen wie Plasmodium falciparum, Entamoeba histolytica und Giardia lamblia12,13. Obwohl die antibakterielle Aktivität von Auranofin weniger erforscht ist, wurde in den letzten Jahren über eine vielversprechende Wirkung auf bestimmte grampositive Krankheitserreger wie Clostridium difficile14, Staphylococcus aureus15 oder Mycobacterium tuberculosis16 berichtet.

Eine der erfolgreichsten Strategien zur Überwindung mikrobieller Resistenzen ist der Einsatz von Nanopartikeln (NPs) als Arzneimittelabgabesysteme, da sie eine vorhersehbare und gewünschte therapeutische Wirkung im menschlichen Körper erzielen können17. Dieser Effekt wird erreicht, wenn die Arzneimittelplasmakonzentration an der betreffenden Stelle innerhalb des therapeutischen Fensters liegt, also unter dem toxischen Wert, aber über dem wirksamen Wert. Daher könnte die anhaltende Freisetzung von Antibiotika aus NPs möglicherweise die Wirksamkeit der Behandlung verbessern. Darüber hinaus wurden NPs verwendet, um antimikrobielle Wirkstoffe gezielt an die Infektionsstelle zu bringen, sodass höhere Dosen des Arzneimittels an der infizierten Stelle verabreicht werden können, wodurch die bakterizide Aktivität bei weniger nachteiligen Nebenwirkungen erhöht wird18. Poly(milch-co-glykolsäure) (PLGA) ist eines der am erfolgreichsten eingesetzten biologisch abbaubaren Polymere, da die nach der Hydrolyse entstehenden Monomere Milchsäure und Glykolsäure endogen sind und vom Körper effizient verstoffwechselt werden. Tatsächlich hat PLGA aufgrund seiner attraktiven Eigenschaften von allen möglichen Biomaterialien, die für die Herstellung von NPs etabliert sind, das Interesse der Arzneimittelverabreichungsgemeinschaft geweckt. Darunter sind Folgendes zu erwähnen: a) die biologische Abbaubarkeit und Biokompatibilität; b) seine Fähigkeit, die Arzneimittelmoleküle vor dem biologischen Abbau zu schützen; und c) die mögliche Entwicklung von Systemen zur verzögerten Freisetzung19,20,21. PLGA-NPs wurden zur Impfstoffabgabe22, zur Krebsbehandlung23, zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen24,25, in der regenerativen Medizin26,27 und sogar zur Behandlung einiger Herz-Kreislauf-Erkrankungen28 eingesetzt. Im Hinblick auf die Behandlung von Infektionen gibt es einige erste Studien, die darauf abzielen, Antibiotika-PLGA-NPs zu entwickeln, um die Behandlung bestimmter bakterieller Infektionen zu verbessern. Verschiedene Antibiotika wurden in PLGA-NPs eingekapselt, beispielsweise Rifampicin und Azithromycin29, Gentamicin30,31,32, Nafcillin33 und Sparfloxacin34. Nach mehreren präklinischen Untersuchungen haben PLGA-NPs ihr antiinfektives Potenzial auf der Grundlage zweier Prinzipien nachgewiesen: Die NPs werden normalerweise durch Endozytose aufgenommen, sodass Antibiotika-PLGA-NPs vielversprechende Abgabesysteme zur Bekämpfung intrazellulärer Infektionen sind; und NPs können eine verzögerte Freisetzung erreichen, sodass Antibiotika-PLGA-NPs zur Behandlung oder Vorbeugung von Infektionen eingesetzt werden können.

In dieser Arbeit haben wir die Verwendung von mit Auranofin beladenen PLGA-NPs untersucht, um als Proof of Concept ihre Wirksamkeit als antibakterielles Mittel gegen zwei wichtige Streptokokken-Pathogene, nämlich S. pneumoniae und S. pyogenes, zu demonstrieren. Vielversprechende Ergebnisse wurden in In-vitro-Tests mit multiresistenten Pneumokokkenstämmen und einem Biofilmmodell von S. pneumoniae und S. pyogenes sowie in vivo mit einem Zebrafischembryo-Infektionsmodell erzielt.

PLGA-NPs, sowohl unbeladene als auch mit Auranofinen beladene, wurden nach der im Abschnitt „Methoden“ beschriebenen Nanopräzipitationsmethode hergestellt. Auranofin wurde erfolgreich in den PLGA-Nanoträger geladen, wie Verdauungsexperimente bestätigten. Die Morphologie der NPs wurde durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) beobachtet (Abb. 1a) und zeigte die erwartete Kugelform der produzierten NPs. Die Beladung mit Auranofin während der Nanopräzipitationsphase hatte keinen Einfluss auf die Morphologie der Partikel (Daten nicht gezeigt).

Auranofin- und PLGA-NPs.

(a) REM-Aufnahme unbeladener PLGA-NPs und Größenverteilung der PLGA-NPs, gemessen mit DLS (Einschub). (b) In-vitro-Freisetzung von Auranofin aus PLGA-NPs und kinetische Anpassung (gestrichelte Linie) der Freisetzungskinetik gemäß einer Ordnung nahe Null. Die chemische Struktur von Auranofin ist in das Panel eingefügt. Ac, Acetyl; Et, Ethyl.

Die Größe der NPs wurde mit einem DLS-Gerät (Dynamic Light Scattering) bewertet. Der mittlere Durchmesser sowohl der unbeladenen als auch der Auranofin-PLGA-NPs betrug ca. 60 nm in beiden Fällen (Abb. 1a). Die Oberflächeneigenschaften wurden durch Zetapotential untersucht und alle NPs waren mit Werten von ca. negativ geladen. −30 mV, wie erwartet.

Das verwendete Verhältnis von Poly(milch)säure zu Poly(glykol)säure sowie deren Molekulargewichte wurden so ausgewählt, dass sie einem bestimmten Abbaumuster folgen, das die Freisetzungskinetik steuert, sodass in den ersten 6 Stunden des Experiments eine konstante Freisetzung von Auranofin erreicht wurde. Die Freisetzungskinetik von PLGA-NPs basiert hauptsächlich auf dem PLGA-Abbau durch Hydrolyse seiner Esterbindungen in Gegenwart von Wasser. In diesem Fall sollte das typische Freisetzungsprofil von PLGA-NPs aus einer Phase nullter Ordnung bestehen. Es gibt jedoch auch andere Effekte, die die Freisetzungskinetik beeinflussen, wie z. B. Oberflächendiffusion, Massendiffusion, Variation des Polymermolekulargewichts und Erosion der NPs. Sie alle tragen zu einem komplexen Prozess bei, der sich nur sehr schwer in einer einzelnen Gleichung reproduzieren lässt. In unserem speziellen Fall können die in Abb. 1b gezeigten Auranofin-Freisetzungsdaten an ein kinetisches Modell nahe nullter Ordnung angepasst werden, indem folgende Gleichung verwendet wird:

Dabei ist Qt der Prozentsatz des zum Zeitpunkt t freigesetzten Auranofins, Q0 die Anfangsmenge an Auranofin in der Lösung (normalerweise Q0 = 0), k die Freisetzungskonstante und n der Faktor, der bei reiner Freisetzung nullter Ordnung (Abbau von Polymeren) 1 ist Matrix) und 0,5 in der Freisetzung vom Higuchi-Typ (Diffusion von Arzneimittelmolekülen).

Die in Abb. 1b gezeigten Parameter der kinetischen Anpassung zeigen, dass unser Freisetzungsprozess weder eine reine Nullfreisetzung (Abbau) noch eine reine Higuchi-Freisetzung (Diffusion) ist, sondern irgendwo in der Mitte (n = 0,81), eine nahezu Kinetische Freisetzung nullter Ordnung.

Um die bakterizide Aktivität von Auranofin allein oder mit Auranofin beladenen NPs zu vergleichen, wählten wir zunächst den nicht eingekapselten Stamm S. pneumoniae R6. Es ist wichtig zu beachten, dass Pneumokokkenstämme nach mehreren Stunden stationärer Wachstumsphase eine Autolyse zeigen. Daher wurde die Inkubationszeit angepasst, um die Freisetzungskinetik von Auranofin und die bakterielle Autolyse unter den getesteten Bedingungen zu berücksichtigen. Die Verbindungen wurden einer Bakteriensuspension mit einer OD550 von 0,6 in drei verschiedenen Konzentrationen (0,1, 0,25 und 0,5 μM) zugesetzt und die optische Zelldichte wurde während der gesamten Wachstumskurve verfolgt. Die Zählung lebensfähiger Zellen zeigte, dass Auranofin allein als Anti-Pneumokokken-Mittel wirksam war, da eine 6-stündige Inkubation bei 0,5 μM die Bakterienpopulation um etwa drei log-Einheiten verringerte (Abb. 2a), wohingegen mit Auranofin-NPs behandelte Kulturen bei Konzentrationen von praktisch sterilisiert wurden 0,25 oder 0,5 μM (Abb. 2b). Anschließend wurde die bakterizide Aktivität von Auranofin-beladenen NPs auch unter Verwendung eingekapselter Pneumokokken-Isolate, nämlich der Stämme D39, 48 und 69, getestet (Tabelle 1). Wie im vorherigen Test verursachte freies Auranofin bei dem multiresistenten Stamm 48 bei 0,5 μM eine Verringerung der Lebensfähigkeit um fast drei Logarithmen (Abb. 2c), wohingegen Auranofin-NPs auch bei 0,25 μM zur vollständigen Abtötung der Kultur führten (Abb. 2d). Vergleichbare Ergebnisse wurden mit dem Stamm D39 (Serotyp 2) und dem multiresistenten Stamm 69 (Serotyp 19F) erzielt (Tabelle 2). Um zu bestätigen, dass die bakterizide Wirkung durch das von den NPs freigesetzte Auranofin und nicht durch die NPs selbst hervorgerufen wurde, wurden in allen Experimenten immer unbeladene PLGA-NPs getestet, was zeigte, dass der Nanoträger die Bakterienpopulation nicht veränderte.

Bakterizide Wirkung von Auranofin- und Auranofin-PLGA-NPs gegen Pneumokokkenstämme.

Exponentiell wachsende Kulturen der Stämme R6 (a,b) und 48 (c,d) wurden in Abwesenheit oder in Gegenwart von Auranofin allein (a,c) oder Auranofin-NPs (b,d) inkubiert. Kontrollen mit PBS-Puffer, DMSO oder PLGA ohne Auranofin waren enthalten. Lebensfähige Zellen wurden auf Blutagarplatten nach 6-stündiger Inkubation bei 37 °C bestimmt. Die Daten sind Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar und Sternchen zeigen an, dass die Ergebnisse im Vergleich zur Kontrolle in Abwesenheit von Auranofin statistisch signifikant sind (einfaktorielle ANOVA mit einem Post-hoc-Dunnet-Test; *P < 0,01; **P < 0,001).

Als nächstes testeten wir die Wirksamkeit von Auranofin, allein oder beladen in NPs, gegen zwei Stämme von S. pyogenes, den Typusstamm und SF370, wobei letzterer ein typischer biofilmbildender Stamm ist. Wie in Tabelle 2 gezeigt, erreichte die bakterizide Wirkung bei diesen Stämmen nicht das gleiche Ausmaß wie bei Pneumokokkenstämmen. Tatsächlich hatte freies Auranofin selbst bei der getesteten Maximalkonzentration (0,5 μM) keinen Einfluss auf das Überleben des Stamms vom Typ S. pyogenes, verursachte jedoch einen Rückgang der Lebensfähigkeit des Stamms SF370 um 90 %. Es ist jedoch erwähnenswert, dass Auranofin-NPs beide S. pyogenes-Stämme effektiv abtöteten, mit einer Abnahme um 1- bzw. 2-Logs beim Typ-Stamm und beim SF370-Stamm, was die erhöhte Effizienz von Auranofin bestätigt, wenn es in NPs geladen wurde. im Vergleich zu Auranofin allein.

Einer der Gründe für die höhere Wirksamkeit von in PLGA-NPs geladenes Auranofin gegen Streptokokken-Pathogene könnte in einer besseren Stabilität des eingekapselten Arzneimittels und damit im Schutz vor einem schnellen enzymatischen und/oder hydrolytischen Abbau liegen26. Um dieses Problem zu untersuchen, führten wir bakterizide Tests gegen S. pneumoniae R6 durch und fügten stündlich Auranofin-Pulse hinzu, um die langsame Freisetzung zu simulieren, die aus den Auranofin-NPs erfolgt. Die Einstellung auf eine Endkonzentration von 0,5 μM Auranofin durch 6 Impulse verringerte die Bakterienpopulation nach 6 Stunden Behandlung um 6 Logs, während die gleiche Konzentration an Auranofin, die auf einmal zu Beginn des Experiments hinzugefügt wurde, einen Rückgang der Lebensfähigkeit um fast 4 Logs verursachte (Abb. 3). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Behandlungen mit wiederholten Dosen Auranofin wirksamer gegen Pneumokokken-Infektionen sein könnten als eine hohe Einzeldosis. Mit anderen Worten: Die Einkapselung von Auranofin in PLGA-NPs ermöglicht ein gutes Abgabesystem, da eine anhaltende Freisetzung des Arzneimittels die Effizienz der Behandlung erhöht.

Bakterizide Wirkung von Auranofin-Pulsen gegen S. pneumoniae R6.

Exponentiell wachsende Kulturen wurden in Gegenwart einer Endkonzentration von 0,5 μM Auranofin unter drei verschiedenen Bedingungen inkubiert: als Einzeldosis zu Beginn des Experiments (Auranofin), durch 1-stündige Impulse für 6 Stunden (Auranofin-Impulse), oder in PLGA-NPs (Auranofin-PLGA-NPs) geladen werden. Kontrollen mit PBS-Puffer, DMSO oder PLGA ohne Auranofin waren ebenfalls enthalten. Lebensfähige Zellen wurden auf Blutagarplatten nach 6-stündiger Inkubation bei 37 °C bestimmt. Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar und Sternchen zeigen an, dass die Ergebnisse im Vergleich zur Kontrolle in Abwesenheit von Auranofin statistisch signifikant sind (einfaktorielle ANOVA mit einem Post-hoc-Dunnet-Test; *P < 0,01; **P < 0,001).

Freies Auranofin und in NPs beladenes Auranofin wurden zunächst am Stamm S. pneumoniae P046 in Konzentrationen von 0,25, 0,5 und 1 μM getestet. Dieser zu Biofilmen neigende Stamm führt aufgrund seines Mangels an LytA- und LytC-Autolysinen nach langen Inkubationsperioden weder bei 30 °C noch bei 37 °C zu einer Autolyse. Eine positive Wirkung eines Arzneimittels gegen bakteriellen Biofilm zeigt sich in der Verringerung der Biofilmbildung aufgrund der Zerstreuung der Zellen und, was am wichtigsten ist, in der tödlichen Wirkung des Arzneimittels auf die verbleibenden Zellen. Folglich wurde die bakterizide Wirkung auf den P046-Biofilm nach 6 Stunden der entsprechenden Behandlung überprüft und die Ergebnisse zeigten deutlich, dass das in NPs geladene Arzneimittel im S. pneumoniae-Biofilm gewachsene Zellen wirksamer abtötete als freies Auranofin. Beispielsweise töteten Auranofin-NPs etwa 4 log der Bakterienpopulation bei 0,25 μM (mehr als 99,9 % Mortalität), wohingegen Auranofin allein bei derselben Konzentration praktisch unwirksam war und mindestens 1 μM der Verbindung erforderlich war, um eine Mortalität von 90 % zu erreichen ( Abb. 4a). Darüber hinaus haben wir die gleichen Behandlungen am S. pyogenes SF370-Stamm, der als Biofilm gezüchtet wurde, bei den gleichen zuvor verwendeten Konzentrationen überprüft. Die Ergebnisse in diesem Fall waren denen des vorherigen Experiments sehr ähnlich, da Auranofin-NPs in einer Konzentration von 0,25 μM in der Lage waren, die gleichen 4 Logs an Bakterienzellen abzutöten. Bemerkenswert ist ein dramatisch unterschiedliches Verhalten der tödlichen Aktivität zwischen freiem und eingekapseltem Auranofin im Vergleich zu planktonischen und im Biofilm gezüchteten Kulturen beider Krankheitserreger, S. pneumoniae und S. pyogenes. Wie in Abb. 4 und Tabelle 2 gezeigt, zeigte freies Auranofin eine stärkere bakterizide Wirkung auf Planktonzellen als auf Biofilmzellen des Stammes S. pyogenes SF370 (ca. 1 bzw. 0,5 log-Abnahme bei 0,5 μM). Im Gegensatz dazu waren Auranofin-beladene PLGA-NPs gegenüber dem Biofilm beider Bakterien deutlich tödlicher als die gleichen planktonisch gewachsenen Zellen (>4 bzw. 2 log-Abnahme bei 0,5 μM für S. pyogenes).

Mit Auranofin oder Auranofin-PLGA-NPs behandelte Streptokokken-Biofilme.

(a) Als Biofilm gezüchtete Zellen des Stammes S. pneumoniae P046 wurden 6 Stunden lang bei 37 °C mit 0,25, 0,5 und 1 μM Auranofin und Auranofin-PLGA-NPs behandelt. (b) Als Biofilm gezüchtete Zellen des Stammes S. pyogenes SF370 wurden 6 Stunden lang bei 37 °C mit 0,25, 0,5 und 1 μM Auranofin und Auranofin-PLGA-NPs behandelt. Zu den Kontrollen gehörten Biofilme, die 6 Stunden lang in PBS-Puffer, DMSO oder PLGA-NPs inkubiert wurden. Auf Blutagarplatten wurden lebensfähige Zellen bestimmt. Die Daten stellen den Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten dar. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar und Sternchen zeigen an, dass die Ergebnisse im Vergleich zur Kontrolle in Abwesenheit von Auranofin statistisch signifikant sind (einfaktorielle ANOVA mit einem Post-hoc-Dunnet-Test; *P < 0,01; **P < 0,001).

Nachdem wir die starke Abtötungswirkung von Auranofin-NPs gegen zwei als Biofilm gewachsene Streptokokkenbakterien nachgewiesen hatten, analysierten wir mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) die Feinstruktur des typischen Netzes, das dieses Bakterienwachstum charakterisiert, um die Zelldispersionskapazität aufgrund der Aktivität zu ermitteln von Auranofin-NPs. Diese Analyse wurde am Pneumokokkenstamm P046 und CLSM-Bildern des Biofilms in PBS durchgeführt, und die entsprechenden einer Kontrolle mit unbeladenen PLGA-NPs zeigten eine ähnliche Zelldichte und einen ähnlichen Prozentsatz an lebenden Bakterien (Abb. 5a, b). Im Gegensatz dazu zeigte der mit Auranofin-NPs behandelte Biofilm einen großen Verlust an verbleibenden Pneumokokkenzellen (Abb. 5c), was die tödliche Wirkung von Auranofin bei Beladung mit PLGA-NPs vollständig bestätigte.

CLSM von Pneumokokken-Biofilmen, die mit Auranofin-PLGA-NPs behandelt wurden.

Als Biofilm gezüchtete Zellen des Stamms S. pneumoniae P046 wurden mit PBS (a) oder mit 1 μM PLGA-NPs (b) inkubiert oder mit 1 μM Auranofin-PLGA-NPs (c) 6 Stunden lang bei 37 °C behandelt. Anschließend wurden die Zellen in den Biofilmen mit dem BacLight LIVE/DEAD-Kit gefärbt, um lebensfähige (grüne Fluoreszenz) und nicht lebensfähige (rote Fluoreszenz) Bakterien sichtbar zu machen. Gezeigt werden horizontale dreidimensionale Rekonstruktionen (x-y-Ebene). Stäbe, 25 μm.

Um die in vitro bakteriziden Ergebnisse von Auranofin-NPs in einem Tiermodell der Infektion zu validieren, verwendeten wir ein Zebrafischembryomodell, das kürzlich für S. pneumoniae und S. pyogenes eingerichtet wurde35. Kontrollexperimente mit dem Pneumokokkenstamm D39 zeigten, dass eine bakterielle Belastung mit etwa 2,5 × 108 KBE ml–1 50 % der Embryonen in 4–5 Tagen tötete, wenn sie durch Eintauchen in E3-Medium verabreicht wurde. Daher wurden Zebrafischembryonen 48 Stunden nach der Befruchtung mit dem Erreger in Kontakt gebracht. Acht Stunden nach der bakteriellen Belastung wurden die Embryonen ausgiebig mit demselben Medium gewaschen und mit einer Einzeldosis freiem Auranofin oder Auranofin-NPs in Konzentrationen von 0,1 bis 0,5 μM pro Embryo behandelt. Als Negativkontrolle wurden hitzegetötete (10 Minuten bei 65 °C) D39-Stammzellen verwendet. Die Rettung der mit Auranofin-NPs infizierten und behandelten Embryonen schwankte je nach verwendeter Konzentration, d. h. 100 % Überleben (46/46) bei Behandlung mit 0,5 μM, 93,5 % (43/46) bei Behandlung mit 0,25 μM und 89,1 % (41/ 46) mit 0,1 μM. Diese Ergebnisse zeigten die Wirksamkeit von Auranofin beim Schutz von Embryonen vor einer Pneumokokkeninfektion und auch, dass die Behandlung mit den Auranofin-NPs zu einem um etwa 15 % größeren Schutz führte (P < 0,01) als mit dem Medikament allein, z. B. 73,9 % der Embryonen (34/46). überlebten bei Behandlung mit freiem Auranofin und 89,1 % bei Behandlung mit Auranofin-NPs, beide in der gleichen Konzentration (0,1 μM) (Abb. 6). Die Wirksamkeit von Auranofin bei der Embryonenrettung wurde mit der eines herkömmlichen Antibiotikums wie Ampicillin verglichen, das zur β-Lactam-Familie gehört. Wenn beide Arzneimittel allein in einer Konzentration von 0,5 μM zugesetzt wurden, war die Überlebensrate des Zebrafischembryos 5 Tage nach der Infektion nahezu gleich (84,6 %) (Abb. 6a). Allerdings retteten Behandlungen mit der gleichen Ampicillinkonzentration, die in PLGA-NPs geladen wurde, eine ähnliche Rate an Embryonen (38/46, also 82,6 %), wohingegen Auranofin-NPs bei derselben Konzentration von 0,5 μM eine Überlebensrate von 100 % erreichten (Abb. 6b). . Um die Schutzwirkung von Auranofin-NPs sichtbar zu machen, wurden Embryonen aus allen Versuchsgruppen im Laufe der Zeit auf morphologische Veränderungen überwacht. Embryonen wurden mit einem Stereomikroskop untersucht und es wurde festgestellt, dass mit S. pneumoniae D39 infizierte Embryonen im Vergleich zu den entsprechenden nicht infizierten Kontrollen (Abb. 7a). Allerdings waren infizierte Embryonen, die mit 0,5 μM Auranofin-NPs behandelt wurden, vollständig geschützt und zeigten nicht die typischen Deformitäten, die durch eine Pneumokokkeninfektion hervorgerufen wurden (Abb. 7c).

Rettung von Zebrafischembryonen vor einer Pneumokokkeninfektion durch Auranofin- oder Auranofin-PLGA-NPs.

Dargestellt ist das Überleben von Embryonen, die mit dem Stamm S. pneumoniae D39 infiziert und mit unterschiedlichen Konzentrationen von Auranofin- oder Auranofin-PLGA-NPs behandelt (oder nicht) behandelt wurden (n = 24 bis 36 Embryonen pro Zustand). Kontrollen mit DMSO, Auranofin, Ampicillin allein und geladen in PLGA-NPs waren ebenfalls enthalten. Das Überleben der Embryonen wurde über einen Zeitraum von 5 Tagen überwacht und die Ergebnisse wurden als Kaplan-Meier-Überlebenskurven aufgezeichnet. Die Überlebenskurven wurden mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) und dem Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test (*P < 0,01; **P < 0,001) verglichen.

Mikroskopische Bilder von Zebrafischembryonen, die mit Pneumokokken infiziert und mit Auranofin-PLGA-NPs behandelt wurden.

(a) Nicht infizierte Embryogruppe. (b) Embryogruppe, infiziert mit dem Stamm S. pneumoniae D39 ohne Behandlung. (c) Infizierte Embryogruppe und behandelt mit 0,5 μM Auranofin-PLGA-NPs. Die Bilder wurden 5 Tage nach der Infektion aufgenommen. Abkürzungen: pe, Perikardödem; tm: Schwanzfehlbildung und YSE, Dottersacködem. Stäbe, 500 μm.

Infektionen durch multiresistente Bakterien sind für die globale Gesundheit von großer Bedeutung, da sie häufig tödliche Pathologien hervorrufen. Die besondere Relevanz biofilmbedingter Infektionen wird deutlich, da nach der Behandlung mit hohen Antibiotikakonzentrationen die meisten Bakterien in solchen Biofilmen überlebten, selbst wenn abgestorbene Bakterienzellen die Oberfläche bedeckten7. Die Behandlung von Krankheiten wird vor allem durch den Mangel an wirksamen Antibiotika erschwert; Daher ist die Identifizierung neuer Arzneimittel mit neuartigen Wirkmechanismen zu einer internationalen Priorität geworden36,37. Auranofin ist ein Arzneimittel mit einem an einen Thiozucker und Triethylphosphinreste koordinierten Gold(I)-Zentrum, das kürzlich als wirksames Arzneimittel nicht nur gegen pathogene Protozoen12,13, sondern auch gegen mehrere grampositive und gramnegative Bakterien eingesetzt wurde Die letztere Gruppe war weniger anfällig für die Droge als die erstere. Tatsächlich lagen die MHK-Werte für die am anfälligsten getesteten grampositiven Bakterien zwischen 0,12 und 0,5 μg mL-1, während diese MHK-Werte für einige gramnegative Bakterien wie Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa oder Acinetobacter auf > 16 μg mL-1 anstiegen baumannii15,16. Obwohl der detaillierte Mechanismus der bakteriziden Wirkung von Auranofin nicht aufgeklärt wurde, deuten neuere Daten stark darauf hin, dass die Thiol-Redox-Homöostase das bakterielle Ziel bei M. tuberculosis ist16. Es wurde gezeigt, dass Auranofin die bakterielle Thioredoxinreduktase hemmt, ein Schlüsselprotein in vielen grampositiven Bakterien zur Aufrechterhaltung des Thiol-Redox-Gleichgewichts und zum Schutz vor reaktiven oxidativen Spezies15.

Zunächst konzentrierten wir uns in dieser Studie auf die bakterizide Wirkung von Auranofin gegen zwei klinisch relevante Krankheitserreger, S. pneumoniae und S. pyogenes. Eine Zusammenfassung der Lebensfähigkeitsdaten (siehe Tabelle 2) zeigte, dass dieses Medikament eine starke bakterizide Wirkung gegen alle getesteten Pneumokokkenstämme, einschließlich der multiresistenten, hat, während es gegen die getesteten S. pyogenes-Stämme eher ineffizient war. Der Wert der tödlichen Konzentration für Pneumokokken, 0,5 μM entspricht 0,34 μg mL−1, liegt im Bereich der MHK-Werte, die für andere grampositive Bakterien wie S. aureus und Streptococcus epidermidis angegeben wurden16,38. Nach diesen vielversprechenden Ergebnissen mit dem neu profilierten Auranofin gegen Pneumokokken suchten wir nach einer Methode zur Verbesserung und Erweiterung der bakteriolytischen Wirkung des Arzneimittels, selbst in Biofilmtests, bei denen die Bakterienpopulation toleranter oder resistenter gegenüber Antibiotikatherapien ist. Eine typische Lösung, um dieses Ziel bei der Formulierung von Wirkstoffen zu erreichen, ist das Laden des gewünschten Arzneimittels in einen geeigneten Träger oder NP.

Polymere werden seit mehr als 40 Jahren in der pharmazeutischen Industrie eingesetzt und haben sich von resorbierbaren Nähten und orthopädischen Implantaten zu multifunktionalen NPs entwickelt, die Therapeutika gezielt und kontrolliert freisetzen können. In diesem Sinne hat die Verwendung polymerer NPs zur Entwicklung sichererer und wirksamerer Medikamente, sogenannter Nanomedizin, die pharmazeutische und biotechnologische Industrie erheblich beeinflusst. Unter anderem werden biologisch abbaubare PLGA-NPs aufgrund ihrer zuverlässigen Herstellungsmethoden, der Biokompatibilität (FDA-zugelassen), der biologischen Abbaubarkeit39,40 und der Fähigkeit, Arzneimittel einzukapseln und vor dem Abbau zu schützen21,41, in großem Umfang für eine Vielzahl biologischer Anwendungen eingesetzt. Darüber hinaus ermöglicht das Einschließen (oder Einkapseln) aktiver Moleküle in einem Abgabesystem eine bessere Kontrolle des pharmakokinetischen Verhaltens des gewünschten Arzneimittels. Dieser effizientere Einsatz pharmazeutischer Verbindungen kann einige der Nachteile verringern und bietet die Grundlage für eine Verkürzung der derzeit für klassische Behandlungen erforderlichen Zeit. Dies könnte im Umgang mit Antibiotika von entscheidender Bedeutung sein, da es dazu beitragen könnte, die Resistenz von Bakterien gegen Antibiotika zu vermeiden, die heutzutage eines der Hauptprobleme bei der Behandlung von Infektionen darstellt. In der Literatur gibt es viele Beispiele, bei denen die Einkapselung von Antibiotika in PLGA-NPs deren Effizienz steigert. Beispielsweise waren mit Azithromycin beladene PLGA-NPs wirksamer gegen Salmonella typhi42 als Azithromycin-Lösung. In jüngerer Zeit wurde beschrieben, dass Clarithromicin-PLGA-NPs gegen E. coli, H. influenzae, S. aureus und S. pneumoniae wirksamer sind als unbehandeltes Clarithromicin43. Angesichts der Vorteile von PLGA-NPs und unter Berücksichtigung der verbesserten Wirksamkeit von Antibiotika bei Beladung mit diesem Abgabesystem haben wir Auranofin-PLGA-NPs mit einem Protokoll hergestellt, das die reproduzierbare Bildung von NPs mit Durchmessern unter 100 nm und niedrigen Polydispersitätsindizes ermöglichte weist auf eine homogene Größenverteilung hin.

Nachdem die Beladung und anhaltende Freisetzung von Auranofin aus PLGA-NPs bestätigt wurde, wurden ihre potenziellen Vorteile für die Behandlung von Infektionen bewertet. Insbesondere ermöglichte die Herstellung von Auranofin-PLGA den Vergleich seiner tödlichen Aktivität gegen S. pneumoniae und S. pyogenes mit der von Auranofin allein unter Verwendung von drei Arten von Experimenten als Modellsystemen: i) In-vitro-Studie mit mehreren Pneumokokkenstämmen, einschließlich relevanter multiresistenter Stämme ; ii) Biofilm-Assay an geeigneten Stämmen, wie S. pneumoniae P046 und S. pyogenes SF370; iii) In-vivo-Tiermodell, wie Zebrafischembryonen, die mit S. pneumoniae infiziert sind. Alle diese Ansätze bestätigten die verbesserte Abtötungsaktivität von Auranofin-NPs gegenüber dem freien Auranofin, wobei der Schwerpunkt auf dem Biofilm-Ansatz lag, da die Wirksamkeit des in PLGA geladenen Auranofins zur Zerstreuung und Abtötung der Bakterienpopulation von S. pneumoniae- und S. pyogenes-Biofilmen etwa 4 überstieg protokolliert die mit dem Medikament allein festgestellte Letalität gegen beide Krankheitserreger. Dieses vielversprechende Ergebnis könnte besonders relevant sein, wenn es darum geht, eine zukünftige Behandlung biofilmbasierter Infektionen vorherzusagen, die gegenüber klassischen Antibiotika besonders resistent sind44. Ein weiteres Argument für die klinische Anwendung dieser Art von NPs ergibt sich aus der erfolgreichen Validierung von In-vitro-Tests mit dem Schutz infizierter Zebrafischembryonen, was die Vorteile von NPs als Arzneimittelabgabesystem zur Bekämpfung von Streptokokkeninfektionen hervorhebt.

Die Nanopräzipitationsmethode zur Bildung von Auranofin-verkapselten PLGA-NPs wurde gemäß einem zuvor beschriebenen Verfahren durchgeführt45. Kurz gesagt, 10–15 mg Auranofin [Sigma-Aldrich, >98 % Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)] wurden in 20 ml einer Mischung aus Dichlormethan:Aceton (0,5:19,5) und dann 200 mg PLGA (Aldrich, 50:50, Mw 7.000–17.000) wurden zugegeben und anschließend 2 Minuten lang beschallt (Lösung 1). Separat wurden 56 mg Pluronic F-68 (Sigma) in 40 ml Wasser (0,14 % Gew.-1) in einem 100-ml-Rundkolben unter mäßigem magnetischem Rühren gelöst (Lösung 2). Lösung 1 wurde auf einen Spritzenspender gegeben und dann unter mäßigem magnetischen Rühren tropfenweise (0,25 ml min−1) über Lösung 2 übertragen. Die NPs wurden 2 Stunden lang gerührt und das verbleibende organische Lösungsmittel wurde in einem Rotationsverdampfer bei reduziertem Druck 2 Stunden lang entfernt. Die NPs wurden dann 15 Minuten lang bei 6.600 U/min in einem 7700 RCF-Rotor bei 4 °C zentrifugiert, zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Anschließend wurden die NPs in einer kleinen Menge Wasser suspendiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und gefriergetrocknet. Der gleiche Prozess wurde ohne Auranofin für die Synthese unbeladener PLGA-NPs durchgeführt.

Die sphärische Morphologie der produzierten NPs wurde mittels REM auf einem JEOL JSM 6335F (Electron Microscopy Centre, UCM) bewertet. Die Proben wurden vor der Beobachtung einer Au-Metallisierung unterzogen.

Die durchschnittliche hydrodynamische Größe und der Polydispersitätsindex wurden mit einem DLS-Gerät (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments) gemessen, das mit einem 633-nm-Laser bei 25 °C ausgestattet war. Proben aus den vorbereiteten Suspensionen mit hochreinem Wasser (ca. 0,1 mg mL−1) wurden in die Messzelle gegeben.

Auranofin wurde durch Messung von Au in einer mit Säure aufgeschlossenen Probe durch Atomemissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES, Varian Vista AX Pro) durch die Au-Emissionslinie bei 267,6 nm quantifiziert. Kurz gesagt wurden 10 mg Auranofin-beladene NPs genau abgewogen und in ein mit Teflon ummanteltes Reaktorgehäuse aus Stahl gegeben. Dann wurden 10–20 ml konzentrierte Flusssäure/Salpetersäure (1:1) (Panreac) vorsichtig zugegeben und 48 Stunden lang mäßig erhitzt, bis der Aufschluss vollständig war. Schließlich wurde die klare gelbe Lösung in einen 10-ml-Messkolben gegeben und abgemessen. Die erreichte Wirkstoffbeladung betrug bei allen Synthesen 1,8–6,2 mg Auranofin pro Gramm NPs.

In-vitro-Freisetzungsstudien wurden durchgeführt, indem 10 mg beladene PLGA-NPs in 0,5 ml frischer phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4 [eingestellt auf pH 7,4]) dispergiert wurden. und auf einen durchlässigen Transwell-Träger mit einer 0,4 μm (durchschnittliche Porengröße) Polycarbonatmembran gelegt. Die Vertiefung wurde mit 1,0 ml PBS pH 7,4 gefüllt und die Suspension wurde während des gesamten Experiments mit 100 U/min bei 37 °C kreisförmig geschüttelt. Jede Stunde wurde 1 ml Probe von der Transwell-Platte entnommen und durch frisches PBS ersetzt. Die Trennung und Quantifizierung erfolgte mittels HPLC, ausgestattet mit einem UV-Vis-Detektor, wobei die Absorption von 2-Nitro-5-thiobenzoat (NTB, λmax 409 nm) gemessen wurde. NTB entsteht, wenn Thiolgruppen mit 5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) reagieren und dabei die Disulfidbindung spalten, um NTB in Wasser bei neutralem pH-Wert zu erhalten. Die Proben, die Auranofin enthielten, wurden mit KI behandelt, um die Gold-Thiol-Bindung aufzubrechen46. Zu diesem Zweck wurden 250 μl Probe mit 50 μl KI 2,0 M für 20 Minuten in ein Ultraschallbad bei 50 °C gegeben und dann sofort eisgekühlt, gemäß dem von Sigma bereitgestellten Standardprotokoll. Ein HPLC-Trennmodul (Waters Alliance 2695) (Milford, Massachusetts, USA) basierend auf einer isokratischen mobilen Phase von ACN:MeOH:Wasser (3:3:94, v:v:v) bei einer Flussrate von 1 ml min− 1 wurde zur Trennung und Quantifizierung des NTB-Signals mit einer Retentionszeit von 4,2 Minuten verwendet. Das System war mit einem Diodenarray-Detektor Water 2996 mit variabler Wellenlänge bei 354 nm ausgestattet. Eine Waters X-Terra RP-18 Umkehrphasensäule (4,6 × 250 mm, 5 μm) wurde bei 40 °C verwendet und je nach Fall wurde ein Injektionsvolumen von 10–50 μl ausgewählt. Ein Schema, das die Reaktionen, das Protokoll zur Derivatisierung von Auranofin und das 3D-Chromatogramm beschreibt, ist in Abb. S1 dargestellt.

Die bakterizide Wirkung der mit Auranofin beladenen NPs wurde überwacht, indem die optische Dichte bei 550 nm (OD550) 6 Stunden lang und die lebensfähigen Zellen zu diesem Zeitpunkt verfolgt wurden. Kurz gesagt, S. pneumoniae- und S. pyogenes-Stämme (Tabelle 1) wurden in C-Medium47 bzw. Todd-Hewitt-Medium, ergänzt mit Hefeextrakt (0,8 mg mL−1; Difco Laboratories), bei 37 °C ohne Schütteln gezüchtet. Sobald die Bakterien die exponentielle Wachstumsphase erreichten (OD550 ≈0,3), wurden die Kulturen zentrifugiert und zweimal mit PBS gewaschen und die endgültige OD550 wurde mit PBS auf ≈0,6 eingestellt. Anschließend wurden die resuspendierten Bakterien in Kunststoffröhrchen überführt und unterschiedliche Mengen an Auranofin-PLGA-NPs (suspendiert in PBS) hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,1, 0,25 oder 0,5 μM Auranofin zu erreichen. Kontrollproben mit unbeladenen PLGA-NPs oder Auranofin allein in den gleichen Konzentrationen wurden immer parallel durchgeführt. Zusätzliche Kontrollen mit PBS und Dimethylsulfoxid (DMSO), die zur Solubilisierung von NPs bzw. Auranofin verwendet wurden, waren ebenfalls enthalten. Alle Proben wurden 6 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und die OD550 und lebensfähigen Zellen wurden zu ausgewählten Zeitpunkten bestimmt. Die Zählung lebensfähiger Zellen wurde in Tryptose-Blutagar-Grundplatten (Difco Laboratories) durchgeführt, denen 5 % defibriniertes Schafsblut zugesetzt war. Für jede Probe wurde eine 10-fache Verdünnungsreihe in PBS hergestellt und 10 μl jeder Verdünnung ausplattiert. Die Kolonien wurden nach Inkubation über Nacht bei 37 °C gezählt.

Pneumokokken-Biofilme wurden unter Verwendung des S. pneumoniae-Stamms P046, einer doppelten lytA-lytC-Mutante48, einem Derivat des nicht eingekapselten Laborstamms R649, hergestellt. Die optimalen Bedingungen für die Biofilmbildung auf Polystyrolplatten wurden an anderer Stelle beschrieben50. Kurz gesagt, alle Biofilme wurden in Costar 3595 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatten (Corning, New York, USA) gebildet. Die Zellen wurden in C-Medium, ergänzt mit Hefeextrakt (0,8 mg mL-1), bis zu einer optischen Dichte von 0,5–0,6 bei OD595 gezüchtet, durch Zentrifugation sedimentiert, in einem gleichen Volumen C-Medium resuspendiert, verdünnt und 2,2 × Portionen von 200 μL enthalten In jede Vertiefung wurden 104 KBE gegeben. Nach 16-stündiger Inkubation bei 34 °C wurden die Planktonkulturen entfernt und die resultierenden Biofilme zweimal mit PBS gewaschen und dann weitere 6 Stunden bei 37 °C mit verschiedenen Konzentrationen von Auranofin oder Auranofin-NPs behandelt. Es wurden auch Kontrollen mit DMSO oder unbeladenen NPs getestet. Anschließend wurden die Überstände wieder abgenommen, zweimal mit PBS gewaschen und 10-fache Verdünnungsreihen in PBS hergestellt. 10 μl jeder Verdünnung wurden auf Blutagarplatten ausplattiert und die Kolonien wurden nach Inkubation über Nacht bei 37 °C gezählt. Der S. pyogenes-Biofilm wurde mit dem Stamm SF370 hergestellt, wie zuvor beschrieben51. Kurz gesagt, eine Übernachtkultur von S. pyogenes wurde 1:20 mit frischem Todd-Hewitt-Medium, ergänzt mit Hefeextrakt (0,8 mg mL−1), verdünnt und 24 Stunden lang bei 37 °C statisch in Polystyrol-Mikrotiterplatten gezüchtet. Nach der Inkubation wurde das gleiche Protokoll wie oben für die Pneumokokken-Biofilme beschrieben befolgt.

Um Biofilme durch CLSM zu beobachten, wurde der Stamm S. pneumoniae P046 16 Stunden lang bei 34 °C auf WillCo-Schalen mit Glasboden (WillCo Wells) gezüchtet. Nach der Inkubation wurde das Kulturmedium entfernt und der Biofilm mit PBS gespült, um nicht anhaftende Bakterien zu entfernen, und dann weitere 6 Stunden bei 37 °C mit 1 μM Auranofin-NPs behandelt. Kontrollbiofilme mit PBS oder unbeladenen PLGA-NPs wurden ebenfalls untersucht. Anschließend wurden die Überstände erneut entnommen und anschließend mit dem LIVE/DEAD BacLight Bakterienlebensfähigkeitskit L-13152 (Invitrogen-Molecular Probes) zur Überwachung der Lebensfähigkeit von Bakterienpopulationen gefärbt. Zellen mit einer beeinträchtigten Membran – die als tot oder sterbend gelten – färben sich rot, wohingegen Zellen mit einer intakten Membran grün färben48. Die Biofilme wurden bei 63-facher Vergrößerung mit einem Leica TCS-SP2-AOBS-UV CLSM beobachtet. Die Anregungs-/Emissionsmaxima lagen bei etwa 488/500–546 nm. Die Bilder wurden mit der LCS-Software (Leica) analysiert. Projektionen wurden durch die x-y-Ebene erhalten (einzelne Scans in Abständen von 0,5 μm).

Das Pneumokokken-Infektionsmodell basierte auf einer zuvor beschriebenen Methode35 unter Verwendung von Wildtyp-Zebrafischembryonen (Danio rerio), die von ZFBioLabs (Tres Cantos, Spanien) erhalten wurden. Kurz gesagt, die Embryonen wurden 24 Stunden nach der Befruchtung durch 1-minütige Behandlung mit Pronase (2 mg mL-1) entchorioniert, auf Platten mit 96 Vertiefungen verteilt und in 100 μl E3-Medium inkubiert. 48 Stunden nach der Befruchtung wurden Embryonen mit 100 μl einer 2,5 × 108 koloniebildenden Einheiten (KBE) ml-Suspension des S. pneumoniae-Stammes D39 infiziert. Die bakteriellen Inokulationstiter wurden für jedes Experiment durch Reihenverdünnung und Ausplattieren auf Tryptose-Blutagarplatten berechnet. Sieben Stunden nach der Infektion wurden infizierte Embryonen ausgiebig mit E3-Medium gewaschen, um die Bakterien zu entfernen, und 100 μl desselben autoklavierten frischen Mediums, ergänzt mit Auranofin (0,1, 0,25 oder 0,5 μM) oder Auranofin-beladenen NPs (enthaltend mit der gleichen Konzentration des Arzneimittels). ) wurden hinzugefügt. Nicht infizierte Kontrollen ohne Behandlung oder behandelt entweder mit DMSO, Auranofin oder unbeladenen PLGA-NPs wurden auf die gleiche Weise gewaschen. Die Embryonen wurden unter sterilen Bedingungen bei 27,5 °C inkubiert und die Mortalität in allen Proben 5 Tage lang verfolgt, wobei täglich frisches E3-Medium gewechselt wurde. Zebrafischembryonen galten als tot, wenn eine Koagulation beobachtet wurde und während der 15-sekündigen Beobachtung kein Herzschlag mehr auftrat. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt und pro Bedingung und Experiment wurden 24 bis 36 Embryonen verwendet.

Alle Experimente mit Zebrafischembryonen wurden unter strikter Einhaltung der neuen EU-Tierschutzrichtlinie 2010/63/EU durchgeführt. Anzeichen einer Infektion wurden während des gesamten Versuchszeitraums dreimal täglich überwacht. Sterbende Embryonen wurden durch Eintauchen in Tricain (MS222) (Sigma-Aldrich) bei 200 mg mL-1 anästhesiert, gefolgt von einer Immobilisierung durch Eintauchen in Eiswasser (5 Teile Eis/1 Teil Wasser, 0–4 °C) für mindestens 20 min, um den Tod durch Hypoxie sicherzustellen. Die Genehmigung für diese Versuchsprotokolle wurde durch das spanische Königliche Dekret 53/2013 erteilt, das grundlegende Standards für den Schutz von Tieren festlegt, die in Tierversuchen und anderen wissenschaftlichen Zwecken verwendet werden.

Lebende Embryonen (5 Tage nach der Infektion) wurden wie oben beschrieben behandelt, um den Tod sicherzustellen, in 3 % Methylzellulose in Depressionsobjektträgern montiert und unter einem Olympus SZX16-Stereoskop mit einer QImaging MicroPublisher 5.0 RVT-Kamera fotografiert. Die Bilder wurden mit NIH ImageJ verarbeitet. Für alle beschriebenen Experimente sind die gezeigten Bilder repräsentativ für die bei mindestens 90 % der Personen beobachteten Effekte.

Alle In-vitro-Ergebnisse sind repräsentativ für Daten aus wiederholten unabhängigen Experimenten und jeder Wert stellt die mittlere Standardabweichung für 3 bis 4 Replikate dar. Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests (für zwei Gruppen) durchgeführt, während für mehrere Vergleiche die Varianzanalyse (ANOVA) gewählt wurde. Für alle In-vivo-Daten wurden der Log-Rank-Test (Mantel-Cox) und der Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test verwendet, um die Überlebenskurven zu zeichnen, zu analysieren und zu vergleichen. Für die statistische Analyse wurde GraphPad InStat Version 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) verwendet.

Zitierweise für diesen Artikel: Díez-Martínez, R. et al. Mit Auranofin beladene Nanopartikel als neues therapeutisches Instrument zur Bekämpfung von Streptokokkeninfektionen. Wissenschaft. Rep. 6, 19525; doi: 10.1038/srep19525 (2016).

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Soriano, F. et al. Durchbruch bei der Penicillin-Resistenz? Streptococcus pneumoniae-Isolate mit Penicillin/Cefotaxim-MHK von 16 mg/L und ihrer genotypischen und geografischen Verwandtschaft. J. Antimicrob. Chemother. 62, 1234–1240 (2008).

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Referenzen herunterladen

Wir danken E. García für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die hervorragende technische Unterstützung von E. Cano wird sehr geschätzt. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien (SAF2012-39444-C02-01, MAT2012-35556 und CSO2010-11384-E, Aging Network of Excellence) finanziert. Wir danken auch dem National Electron Microscopy Center der UCM für die SEM-Analysen.

Roberto Diez-Martinez

Aktuelle Adresse: The Zebrafish Lab, Plaza CEIN 5 A4, 31110, Noáin, Navarra, Spanien

Díez-Martínez Roberto und García-Fernández Esther haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Infektionsbiologie, Zentrum für biologische Forschung (CSIC), Madrid, 28040, Spanien

Roberto Díez-Martínez, Esther García-Fernández, Mirian Domenech und Pedro García

CIBER für Atemwegserkrankungen (CIBERES), Madrid, Spanien

Roberto Díez-Martínez, Esther García-Fernández, Mirian Domenech und Pedro García

Abteilung für anorganische und bioanorganische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Universität Complutense Madrid, Krankenhaus des Gesundheitsforschungsinstituts 12 de Octubre, i+12, Pz/ Ramón y Cajal s/n, Madrid, 28040, Spanien

Miguel Manzano, Ángel Martínez und María Vallet-Regí

CIBER für Bioingenieurwesen, Biomaterialien und Nanomedizin (CIBER-BBN), Spanien

Miguel Manzano, Ángel Martínez und María Vallet-Regí

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MV-R. und PG konzipierte die Forschung. RD-M., EG-F., MM, MV-R. und PG entwarf die Experimente. RD-M., EG-F., MD, AM und MM führten die Experimente durch und analysierten die Daten. RD-M., EG-F., MM, MV-R. und PG hat die Arbeit geschrieben. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse, redigierten und genehmigten das Manuskript.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Díez-Martínez, R., García-Fernández, E., Manzano, M. et al. Mit Auranofin beladene Nanopartikel als neues therapeutisches Instrument zur Bekämpfung von Streptokokkeninfektionen. Sci Rep 6, 19525 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19525

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Eingegangen: 22. Juli 2015

Angenommen: 14. Dezember 2015

Veröffentlicht: 18. Januar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep19525

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